作者hurp (修身齐家治国赚大钱)
看板Biotech
标题Re: [问题] cloning
时间Wed Nov 1 16:17:38 2006
小弟的cloning 算是比较土法链钢的, 提出来跟大家讨论一下.
我基本上是做PCR subcloning, insert大小从1kb~3kb不等.
通常是用pfu, 30 cycle. 前题是PCR确定能work, 并尽量减少
template的量.一个sample跑两管PCR, 这样子PCR product比较多.
把两管PCR product收集在一起,
加入1/10体积的3M Na-Acetate,
再加入10倍体积的纯乙醇, 置於室温15分钟
室温离心, 14000rpm, 15分钟, 结束後应该可以看到有白色沉淀
倒掉上清液, 用70%酒精清洗沉淀物, 再离心, 去掉酒精
白色沉淀完全乾燥後, 用30 micro-liter的水回溶.
把回溶的PCR产物全部拿去做enzyme digestion (我的primer有设计RE site), overnight
第二天把sample进行gel extraction, PCR product的量应该是很够"消耗"的了.
土法链钢, 见笑了, 不过我用得还挺顺手的,而且很适合经费短缺的Lab...唉...
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◆ From: 69.115.156.190
1F：推 melodyrabbit:我觉得有时候手动的纯度浓度反而比kit好喔! 11/01 16:58
2F：推 Locutus:为什麽PCR产物还要enzyme digestion啊? 11/01 18:21
3F：推 ssuny:因为不是做TA cloning..接一般的vector当然要用RE处理 11/01 20:06
4F：推 mandible:不太懂??pfu可以做clone吗? 11/01 23:46
5F：推 Locutus:还是不懂,primer设计RE site是在两条primer上再加RE site 11/02 17:10
6F：→ Locutus:这样PCR product出来不是就可以直接接进cloning site了吗? 11/02 17:11
7F：→ Locutus:不好意思,我没做过cloning,所以有这种问题 11/02 17:12