作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问 genomic DNA 的 PCR
时间Sun Nov 12 20:45:24 2006
※ 引述《ZecAhau (World Peace)》之铭言：
: 各位好
: 我现在是用 人类细胞株中抽取的 genomic DNA 当作 template 进行 PCR
: 想要 P 出一段长度约 3 K 的 promoter region
: 之前可能因为 primer 没有设计好 一直 P 不出来
: 重新设计 primer 後 是可以在正确位置看得到 band
: 可是 不管怎麽改变 annearing 的温度 DNA template 的量..
: 甚至是增加 cycle 数 (35 --> 40)
: 都没有办法让这 band 的 signal 强一点
: 量一直都非常少....
: 我的 PCR condition 如下:
: 98 ℃, 3 min
: 98 ℃ 1 min
: 61.0 or 58.0 ℃ 40 sec
: 72 ℃ 3 min ×35 or 40
: 72 ℃ 10 min 4 ℃ ∞
: DNA template 的量 则是从 3 ng --> 2 ug 都试过了
: 不是 P 不出 就是只有微弱的 band
: Primer 则 FW RV 各加 100ng
: 要提到的是 因为是 promoter region
: 两个 primer 都有 GC-rich 的情况
: FW 还好 ( 55 %)
: 但 RV 的 GC 高达 66.67 %
: 不知道这是否影响了我 PCR 的产率?
: 还是 DNA template 不够乾净??
: 或说这样的 PCR 还有什麽需要特别留意的地方??
: 谢谢各位的指教~~谢谢!!
试试DMSO或Betaine吧.......还有taq用好一点的.....祝你好运
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.58.54.177
1F：推 ZecAhau:已经有加 8% DMSO了 DNAP 也换过多种 现在这种很"高级"罗 11/12 23:02
2F：→ ZecAhau:还是很谢谢你 :) 11/12 23:06
3F：→ apa9394:pfU吗XDDD 11/13 15:13