作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)
看板Biotech
标题Re: [问题] cloning & TA cloning
时间Fri Nov 17 22:15:58 2006
※ 引述《Katoh (人工智慧)》之铭言：
: 版上的高手大家好 有问题想请教大家
: 我的insert是primer有设计RE的PCR product(2.8k)
: 质体是pGEX-2TK(4.9k)
: 这阵子做cloning试了好几次
: (两种RE insert跟plasmid分别各切4hr後
: 用gel extraction分别纯化後在ligation 16hr)
: 最後挑出来的菌去抽质体都是原始质体
2.8k确实不好接....我上一个用了2个多月....很惨
我後来也是先进TA vector 再去切plasmid eluted...才成功的
: 因此想改用TA cloning先接上去之後再切
: 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
: (分别是SmaI&EcoRI)
: 跟vector上的切口还蛮接近的 不知道这样会不会有影响
: 还有一点请教大家
: 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是邻近的两个切口
: GGATCCCCGGGAATTCATCG (黄色是SmaI 红色是EcoRI)
: CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (绿色的base两个RE都有用到)
: (不知道画这样看不看的懂)
: 是否可能因为太靠近导致vector其实只切了一边的刀口
: 所以後续ligation失败
你的考量是正确的
我帮你查了一下EcoRI没问题.....但SmaI 如果左右 两个Base切两小时的效率是10%
建议你先切SmaI heat inactivated後再切EcoRI啦
: 谢谢大家
: 顺便请问大家哪家的TA cloning比较好用呢?
: 问题有点多 真不好意思 再次感谢!
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