※ 引述《Katoh (人工智慧)》之铭言： : 版上的高手大家好 有问题想请教大家 : 我的insert是primer有设计RE的PCR product(2.8k) : 质体是pGEX-2TK(4.9k) : 这阵子做cloning试了好几次 : (两种RE insert跟plasmid分别各切4hr後 : 用gel extraction分别纯化後在ligation 16hr) : 最後挑出来的菌去抽质体都是原始质体 : 因此想改用TA cloning先接上去之後再切 : 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有 : (分别是SmaI&EcoRI) : 跟vector上的切口还蛮接近的 不知道这样会不会有影响 : 还有一点请教大家 : 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是邻近的两个切口 : GGATCCCCGGGAATTCATCG (黄色是SmaI 红色是EcoRI) : CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (绿色的base两个RE都有用到) : (不知道画这样看不看的懂) : 是否可能因为太靠近导致vector其实只切了一边的刀口 : 所以後续ligation失败 : 谢谢大家 : 顺便请问大家哪家的TA cloning比较好用呢? : 问题有点多 真不好意思 再次感谢! 两个RE site重叠...应该是不容易切成功的..因为RE除了本身辨认的site之外, 还需要旁边几个延伸的bases当垫脚的...如果我从NEB的书上看图说故事所得到 的资讯没错的话. 要不要重新设计一端的primer呢? 找不要靠那麽近的RE site...如果vector上 有的话啦...这样子多花一点钱, 但比较确定能做得出来. 祝 实验顺利. 感恩. -- --

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