想请教各位大大关於cloning的问题 我的insert是primer有设计RE的PCR product(1.2K) (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit) vector 是5K 用2种RE分别切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N), 切完之後跑胶,进行gel extraction 以elution buffer回溶 接着进行ligation(> O/N 16度) Insert : Vector 莫耳数比试过 3:1 和 5:1 DNA total 浓度试过 56 和 222 ng (用的是Takara T4 DNA ligase,也换过其他家厂牌) 最後进行transformation (用的是HIT compentent cell,也用过益生的 compentent cell) 我所选用的抗生素是chloramphenicol(试过20和30 μg/ml) 最後一颗菌也没长 > < 我在想会不会是因为vector上2个切点太近的关系(就在隔壁) 所以事实上只切了一刀 不过因为这个vector是从别的实验室取得的 而他们切都成功 似乎驳回我这个想法 不知道板上的大大有没有什麽建议提供给我 已经过了2个月了 都一直没有成功 > < --

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