※ 引述《sswweett (lalala)》之铭言： : 想请教各位大大关於cloning的问题 : 我的insert是primer有设计RE的PCR product(1.2K) : (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit) : vector 是5K : 用2种RE分别切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N), : 切完之後跑胶,进行gel extraction 应该跟长不长得出来没关系,我们实验室如果RE切下来的片段很小就直接 用DNA clean up耶~ : 以elution buffer回溶 : 接着进行ligation(> O/N 16度) : Insert : Vector 莫耳数比试过 3:1 和 5:1 : DNA total 浓度试过 56 和 222 ng : (用的是Takara T4 DNA ligase,也换过其他家厂牌) 会不会是ligation的效率太差? 我们在RE之後会再加phosphotase在vector里~ 成功率会提高! : 最後进行transformation : (用的是HIT compentent cell,也用过益生的 compentent cell) : 我所选用的抗生素是chloramphenicol(试过20和30 μg/ml) : 最後一颗菌也没长 > < : 我在想会不会是因为vector上2个切点太近的关系(就在隔壁) : 所以事实上只切了一刀 : 不过因为这个vector是从别的实验室取得的 而他们切都成功 : 似乎驳回我这个想法 : 不知道板上的大大有没有什麽建议提供给我 : 已经过了2个月了 都一直没有成功 > < 对於怎麽做就是成功不了这件事我也深有同感... 之前也发生过这样的事 後来只好换primer(别的RE cutting site) 竟然可以@@ 或是先接到别的vector再切出来接进去(预计要的那个) 最後也还是找不到问题点在哪...只好换条路走~ --

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