作者BeeMine (一堆无聊人)
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标题Re: [问题] dna extraction from whole blood
时间Tue Dec 5 19:33:35 2006
可以请大家帮我比较以下2个protocol吗？
对於抽8cc有没有什麽问题？哪个比较适合？
RBC ＆ Cell lysis buffer需不需要加量？
谢谢了！
protocol 1:
Cell lysis step:
1. 3ml blood(EDTA) + 3 vol. RBC lysis buffer to 15ml centrifuge tube.
Invert tube, mix well, incubate 10min at RT.
2. 2500rpm, 3min., 4C
3. remove sup., resuspend well white cell pellet.
4. add 3ml cell lysis buffer, mix well at RT.
(if cell clumps were visible after mixing,
incubate 37C till solution is homogenous.)
Protein ppt step:
5. add 1ml 10M NH4OAc to cell lysate.
6. vortex, high speed, 20s. incubate on ice for 5min.
7. centrifuge 3000rpm, 15 min.(repeat 6,7 if pellet not tight)
DNA ppt step:
8. discard sup. to clean tube, add 3ml 100% isopropanol.
9. invert gently, mix well, until white threads form a visible pellet.
10. 2000rpm, 3min.
11. add 3ml 75% ethanol, invert tube(wash DNA).
12. 2000rpm, 1 min, carefully pour off ethanol.
13. air dry.
DNA hydration step:
14. pour adequate ddH2O or TE buffer into DNA tube & tap rapidly until
pellet dissolved. (if dissolved incompletely, heat 65C, 30min.)
protocol 2:
Cell Lysis Step:
1. 将全血离心3000 rpm，10 min.。
2. 加 RBC lysis buffer至玻璃试管2/3的高度，
吸取buffy coat，mix，静置10 min.。
3. 离心2000 rpm，3 min.。
4. 倒掉上清液，(留下WBC)，倒扣卫生纸吸乾，
轻敲玻璃试管底部，使pellet 散开。
5. 加cell lysis buffer 600ul，vortex混合均匀(要完全)，
盖上铝箔纸，置入60℃烘箱 20 min.。
Protein Precipitation Step:
6. 加入10M NH4OAc 200ul，vortex混合均匀(要完全)(清澈)，
transfer到新的eppendorf。
7. 离心10000rpm，10min.。
DNA Precipitation Step:
8. 取上清液到新的eppendorf，加等量(800ul) isopropanol或加到9分满。
9. inverse slowly直到白色丝状物出现(太用力DNA会断)
10. 离心12000rpm，10 min.。
11. 倒掉上清液，加入1ml 70% 酒精wash，
invert 使pellet悬浮。(刮eppendorf)
12. 离心12000 rpm，5 min.。
13. 倒掉上清液，倒扣eppendorf阴乾pellet。(放烘箱加快)
DNA Hydration Step:
14. 完全乾燥後视DNA量，加100~300ul ddH2O，
(DNA量少则加50ul)，加热37~45℃溶解DNA，30min.。
15. -20℃储存 / 取1ul DNA以2% agarose gel check。
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