※ 引述《paua (waiting for good news)》之铭言： : 我染PI出现两个问题, : 麻烦请帮我看图中红色的部分, 谢谢 ^^ : 这是以前染的fibroblast, 是成功的 http://tinyurl.com/y9jpnb : 问题一 相同种类细胞, 但是染到细胞质, 且核部分不明显 http://tinyurl.com/ygtgfb 有可能是染剂未完全进入标地位置以及未冲洗乾净(撇开您细胞质红色影像为其他抗 体之红色萤光)。此张影像似乎有过饱和的感觉(背景都是绿的，理论上应该是黑色) 建议： 染完後用PBS多洗几次，此外PI是镶嵌於DNA双股中。另外细胞质内有mitochondria ，其也含DNA，PI也会染到(一只mitochondria有百个DNA copy) : 问题二 不同种细胞(keratinocyte), 为什麽核中有圆圆区域染不到 : keratinocyte A: http://tinyurl.com/yc6g5g : keratinocyte B: http://tinyurl.com/ycdpt8 : 是因为不同种类细胞而有的特徵吗? : 可是我实在想不出来那应该是细胞核的哪一个细部位置? 有些人说是核仁, : 但核仁的颜色应该要比较深(红), 不是吗? 染有DNA的地方。你AB两张拍到的是正常情况下confocal MS看到的PI结果 造成你问题一与二PI染色的结果不同，除了上述之外还有可能是机器操作的问题 雷射强度过强造成讯号过度饱和，pinhole开太大，杂讯过多都会造成细胞核染PI後一 团红。依本人多年操作confocal MS经验只有细胞核皱缩才会染到一团红红的。 改善实验建议： 使用confocal MS 时pinhole尽量小，雷射强度也是。若讯号过低时建议先稍稍调高雷射 视结果再调pinhole。相信莱卡，蔡斯，bio-rad等品牌都有影像重复叠合最佳化的介面 (kalman等方式)，利用短时间重复扫描计算得到最佳影像。 : 我处理步骤都一样(每个步骤之间都用PBS wash三次): : 1. 细胞固定: 2% paraformaldehyde, 15min, RT : 2. 打 洞: 0.1% triton X-100, 10min, RT : 3. blocking: 1% FBS in PBS 1-2hr, RT : 4. 染 一 抗: 这部分没有问题, 暂不讨论 : 5. 染 二 抗: 同上 : 6. 染 核 PI: 4ug/mL, 5min, RT : 7. 封 片 一个曾经以玩confocal MS为兴趣的过来人 -- 织田信长：「杜鹃不叫，我杀了牠！」 丰臣秀吉：「杜鹃不叫，我想办法让牠叫！」 德川家康：「杜鹃不叫，我等牠叫！」 Angus Tzeng：「杜鹃不叫，我自己叫！XD」 --

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