作者bluejelly (梦里不知身是客)
看板Biotech
标题[问题] Colony PCR: false positive?
时间Wed Dec 13 08:03:20 2006
最近在做很多组cloning
为了省时间省耗材
我以colony PCR找有insert的colony
我先以tip挑菌落 沾到50ul的水中
以95度C加热十分钟
再以这个水补满PCR reaction所需的体积
(dNTP, buffer, Taq, primer都照加 剩下体积用这个补)
(这是敝实验室运作得很好的colony PCR protocol)
我的各reagent浓度都与为先前cloning而跑的PCR相同
program设定也很接近
昨天三组不同的cloning 各挑四个colony
十二个colony跑出来都有正确大小的band
但我不是很信任colony PCR 所以又养了菌今天抽mini-prep
以restriction enzyme digestion再次确认
发现十二个colony中 只有两个是正确的
其他十个都是empty vector
请问有人知道为什麽我的colony PCR会有这麽高的false positive rate吗?
而且为什麽明明没insert
却可以跑得出正确大小的band? 而且都跑得很乾净漂亮 只有一条很亮的正确band
我百思不得其解 @@
会影响stringecy的几个主要因素我控制如下:
[Mg2+]=2.5mM, annealing T = 52度, 无DMSO
还请熟悉colony PCR的人赐教 谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 24.162.236.21
1F：推 enisx:ㄧ个菌里面 有含insert 及没insert的 vextor 12/13 08:32
2F：→ enisx:没含insert的数量少很多但是被PCR放大了 12/13 08:33
3F：→ enisx:o/n culture 後 没insert 长的快多了,当然你mini得到的 12/13 08:33
4F：→ enisx:都是这些没insert的 12/13 08:35
5F：推 Fourfish:建议不要用破菌的水当H2O用 取一般PCR时template的量就好 12/13 23:21
6F：→ Fourfish:这样应该可以降低false positive的状况 12/13 23:25
7F：→ Fourfish:另外可以查查看你的primer会不会和vector产生annealing 12/13 23:27
8F：推 bluejelly:谢谢两位 我想就是像e板友说的 PCR太敏感了 12/14 11:08
9F：→ bluejelly:因我後来发现RE切有insert的 colony PCR会特亮 12/14 11:09
10F：→ bluejelly:稍提高stringecy或减少template大概会比较好~ 12/14 11:10