※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : 有人用过从血液中抽出的cDNA做real-time PCR吗? : 因为本身是用ABI的机器run real-time PCR... : 但一直try不好PCR的condition... : 不然就是有出来後...再做一次就没出来了... : 且Ct值一值都满後面的...40上下... : 所以一直做到没信心...>< : 所以我想请问各位real-time PCR几个问题..以解笨小弟我的疑惑.. : 1.real-time PCR做的时候,反应的量一定要加的很精准吗??? : 2.ABI的real-time PCR是不是都不用设定annealing..这样一定都做的出来喔?? : 3.因为我是用kit抽RNA,但是是用一般方法转cDNA..所以会有可能cDNA转的不好吗? : 4.请问有人用invitrogen这家的kit抽RNA吗?...做後续效果都可做很漂亮吗?? : 5.请高手帮我想一下我该怎麽办...谢谢... 一些经验 随意听听罗 1. 当然越精准越好, 不知你做的是绝对 or 相对定量? 不过基本上看你反应出来的3重覆的sd值就可知道你反应准不准的 不然就是看标准曲线的斜率吧 2. 因为annealing 调件是已经内定了啦 我是不会去动它啦 基本上要动这个先等你其他很多东西都try光了 再来想动这个比较好吧 或是等到你做的很熟练了 要动再动罗 3. 当然有可能啊 不过一般方法也不外乎是用RT转啊 多练练吧 熟练就没问题啦 4. 有啊 我觉得没有太大差异啦 Trizol就很好用了 不外乎抽完用 DNase 处理 , RT转完用 RNase H 处理 PCR先夹夹看是否还有DNA污染 再夹夹看actin是否RT有成功啊 跑胶看RNA品质 测OD看RNA品质 5. 要是我的话 我会回到根本的问题 a. 抽RNA, 抽完用DNase I 处理, 并回收. b. 确认我抽的RNA品质没问题 ( 确认 18s 28s RNA的状况, 并测OD ) c. 先用RNA 做 PCR 测试是否还有DNA的残留 d. 转RT, 转完後以 RNase H 处理　, 回收後做PCR夹 actin or 其它 internal control 确认转RT有成功 e. 确认完Step c 後尽快上机做Q-PCR f. 确认Q-PCR的结果 要精准啊～除了三重覆外～SD值跟标准曲线超重要啊 还有就是NTC 有污染的话此次结果就不能用 e. 每一步骤都要确实确认後再往下做　　不然只是无限循环罢了 那一个步骤发现有问题就请别往下做了　不然老板会生气浪费钱跟珍贵的sample 最後还有一些东东可以说一下 　 就是有心的话啊～　ABI本身的网站上就有教我们该怎麽样玩Q-PCR啦 100页不到啦　　都看完的话　就也差不多就是那样而以 那里面的东西　应该比不论谁告诉你的都还要详尽喔～ 　 嗯　祝你实验顺利罗～～ --

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