※ 引述《shuo218 (快乐的理由)》之铭言： : 最近在抽plasmid 因为我们实验室是第一次接触细菌的实验 : 虽然照protocol下去做 可是抽完的浓度都少的可以 : 下面是我的protocol 还麻烦大家可以帮我解决这个问题 : 1 colony of successfully pGL-transformed E.Coli to 10ml prewarmed LB+ (in tube) : Incubate o/n (16H) 37°C 60rpm : 一次培养2管，然後将两管倒在一起成20ml : Centrifuge the 20ml culture at 10,000g x 5min : 接下来的步骤都是照promega的protocol做的 : 不过最後我们是用40ul回溶 因为上次用100ul觉得量太少 : 结果今天做出来量更少 大概只有0.0125 ug/ul : 实在不知道是哪边出问题 : 因为後面要切 然後ligase 回收 再送到E.coli : 可是前面的量就很少 後面好像根本就没办法做下去 : 大家有什麽好的方法吗?谢谢!! 恩，你的菌养太老了。解决的方法有两个 1: 增加抗生素的浓度，(100ug/ml for ampicillin or 25 ug/ml for Kanamycin) 2. 缩短养菌的时间。 你可能会问，你是照protocol养16小时，为什麽会太老。有几个可能性 a. 你的抗生素加太少。抗生素浓度越高，只要是在菌可以忍受的范围内， plasmid的品质就会越好。 b. 每只菌在不同的medium里面生长速度不依样，同一种medium用不同牌子 的药品配出来的效果也不一样。同一个牌子的药品，用不同的水去配， 结果也会不一样。 c. 你的colony可能很大颗。有可能是菌真的长很好，也有可能你偷懒回家 前才挑colony，然後想说隔天下午来抽plasmid就好。反正要放16小时嘛。 前一天晚上在实验室混到11点挑colony第二天可以混到下午3点才开始做 实验。想想看，2mm的colony里面的菌比1mm的colony多多少？答案是4倍！ 如果1mm的colony养16小时是刚刚好，那你是人家的四倍，那你养了16小时 你的菌量就是人家的4倍。你不觉得很可怕吗？ 如果你要问"为什麽养太老的菌plasmid会变很少"。 因为medium里面的抗生素的量有限，当你养过头以後，medium里面的抗生素都已经被 分解光了，这时候一些没有带plasmid或是plasmid量很少的菌就会出头天。因为他们不 需要再花时间去复制你的plasmid，所以会长得比有带plasmid的菌还要快，到了最後， medium里面大部分就都是没有plasmid的菌了，所以自然你就抽不到plasmid了。 希望这可以解决你的问题。 --

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