※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : 有人用过从血液中抽出的cDNA做real-time PCR吗? : 因为本身是用ABI的机器run real-time PCR... : 但一直try不好PCR的condition... : 不然就是有出来後...再做一次就没出来了... : 且Ct值一值都满後面的...40上下... : 所以一直做到没信心...>< : 所以我想请问各位real-time PCR几个问题..以解笨小弟我的疑惑.. : 1.real-time PCR做的时候,反应的量一定要加的很精准吗??? : 2.ABI的real-time PCR是不是都不用设定annealing..这样一定都做的出来喔?? : 3.因为我是用kit抽RNA,但是是用一般方法转cDNA..所以会有可能cDNA转的不好吗? : 4.请问有人用invitrogen这家的kit抽RNA吗?...做後续效果都可做很漂亮吗?? : 5.请高手帮我想一下我该怎麽办...谢谢... 1.是的,要尽可能精准 2.我们实验室用的是Roche的机器,不过所有program的温度跟时间都可以调整,因为每一个 基因都不一样,同样的条件不可能适用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI机器 没用过,所谓的不能改条件意思是???? 3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一样,quality没问题,reverse transcription只要没有 RNase污染就没问题 4.要check RNA quality就直接跑个gel来看,28S/18S的band正确,比例也正确就可以 5.crossing point 40是太低了,应该就是没有东西吧...你测过抽出来的RNA的浓度吗? 你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外, 你做过house keeping gene的real-time PCR吗?这样可以直接确定你的cDNA有没有问题. 还有一点就是可以加上一个positive control,plasmid或是PCR fragment,这样才能 确定至少real time PCR的过程没有问题.. 以上 --

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