※ 引述《fjubiology (Science阅读俱乐部)》之铭言： : ※ 引述《paua (waiting for good news)》之铭言： : : 我染PI出现两个问题, : : 麻烦请帮我看图中红色的部分, 谢谢 ^^ : : 这是以前染的fibroblast, 是成功的 http://tinyurl.com/y9jpnb : : 问题一 相同种类细胞, 但是染到细胞质, 且核部分不明显 http://tinyurl.com/ygtgfb : 有可能是染剂未完全进入标地位置以及未冲洗乾净(撇开您细胞质红色影像为其他抗 : 体之红色萤光)。此张影像似乎有过饱和的感觉(背景都是绿的，理论上应该是黑色) : 建议： : 染完後用PBS多洗几次，此外PI是镶嵌於DNA双股中。另外细胞质内有mitochondria : ，其也含DNA，PI也会染到(一只mitochondria有百个DNA copy) : : 问题二 不同种细胞(keratinocyte), 为什麽核中有圆圆区域染不到 : : keratinocyte A: http://tinyurl.com/yc6g5g : : keratinocyte B: http://tinyurl.com/ycdpt8 : : 是因为不同种类细胞而有的特徵吗? : : 可是我实在想不出来那应该是细胞核的哪一个细部位置? 有些人说是核仁, : : 但核仁的颜色应该要比较深(红), 不是吗? : 染有DNA的地方。你AB两张拍到的是正常情况下confocal MS看到的PI结果 : 造成你问题一与二PI染色的结果不同，除了上述之外还有可能是机器操作的问题 : 雷射强度过强造成讯号过度饱和，pinhole开太大，杂讯过多都会造成细胞核染PI後一 : 团红。依本人多年操作confocal MS经验只有细胞核皱缩才会染到一团红红的。 : 改善实验建议： : 使用confocal MS 时pinhole尽量小，雷射强度也是。若讯号过低时建议先稍稍调高雷射 : 视结果再调pinhole。相信莱卡，蔡斯，bio-rad等品牌都有影像重复叠合最佳化的介面 : (kalman等方式)，利用短时间重复扫描计算得到最佳影像。 : : 我处理步骤都一样(每个步骤之间都用PBS wash三次): : : 1. 细胞固定: 2% paraformaldehyde, 15min, RT : : 2. 打 洞: 0.1% triton X-100, 10min, RT : : 3. blocking: 1% FBS in PBS 1-2hr, RT : : 4. 染 一 抗: 这部分没有问题, 暂不讨论 : : 5. 染 二 抗: 同上 : : 6. 染 核 PI: 4ug/mL, 5min, RT : : 7. 封 片 : 一个曾经以玩confocal MS为兴趣的过来人 我帮你看过你的DATA了 以第二张为主作讨论 请直接换掉原来使用的PI 重新泡过新的..(新鲜很重要) 再重新试试看... 另外 PI染完要记得也要用PBS wash3次 大概是这样 因为第一张图的确是成功的 代表手法没问题 confocal也没问题 再来不同的细胞的确染出来的PI效果会不一样 基本上你的keratinocytes图算是合理的 如果你希望连里面的核仁都染到的话 改变打洞时间和染PI时间 应该会有点改善 confocal的强度亮度基本上是OK的 但是以P大所说的 第二张图的背景的确过量 可以以P大的方式来改善背景问题 我曾经是confocal操作员 学生常有像你一样的问题 所以大致照上面情形改善吧 如果仍然有问题 再详细点说明你的情况罗... 加油加油... --

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