※ 引述《puec ()》之铭言： : ※ 引述《shuo218 (快乐的理由)》之铭言： : 恩，你的菌养太老了。解决的方法有两个 : 1: 增加抗生素的浓度，(100ug/ml for ampicillin or 25 ug/ml for Kanamycin) : 2. 缩短养菌的时间。 : 你可能会问，你是照protocol养16小时，为什麽会太老。有几个可能性 : a. 你的抗生素加太少。抗生素浓度越高，只要是在菌可以忍受的范围内， : plasmid的品质就会越好。 : b. 每只菌在不同的medium里面生长速度不依样，同一种medium用不同牌子 : 的药品配出来的效果也不一样。同一个牌子的药品，用不同的水去配， : 结果也会不一样。 : c. 你的colony可能很大颗。有可能是菌真的长很好，也有可能你偷懒回家 : 前才挑colony，然後想说隔天下午来抽plasmid就好。反正要放16小时嘛。 : 前一天晚上在实验室混到11点挑colony第二天可以混到下午3点才开始做 : 实验。想想看，2mm的colony里面的菌比1mm的colony多多少？答案是4倍！ : 如果1mm的colony养16小时是刚刚好，那你是人家的四倍，那你养了16小时 : 你的菌量就是人家的4倍。你不觉得很可怕吗？ : 如果你要问"为什麽养太老的菌plasmid会变很少"。 : 因为medium里面的抗生素的量有限，当你养过头以後，medium里面的抗生素都已经被 : 分解光了，这时候一些没有带plasmid或是plasmid量很少的菌就会出头天。因为他们不 : 需要再花时间去复制你的plasmid，所以会长得比有带plasmid的菌还要快，到了最後， : medium里面大部分就都是没有plasmid的菌了，所以自然你就抽不到plasmid了。 : 希望这可以解决你的问题。 先谢谢这位板友精采详细的解说 根据大家的解答，我想我也发现了自己的问题 (1)摇菌前，我挑的其实不是colony了，可以说是挑了一坨菌到broth里面去长，而且摇 菌的时间还长达快要24小时，所以菌量太多是一个问题所在 但是我想问，因为我们实验室用的是DH-5alpha的E.coli，他的copy number好像并不高， 那如果我照promega的protocol所说的low-copy-number plasmids最多可用到10ml增菌， 那增菌完要抽plasmid时，是不是再分装成较少体积的量再抽会比较好? 那减少养菌时间，那到底要多久呢?其实我养到後面要做实验的时候，都已经可以看到一 些丝状的悬浮物跟沉淀在下面，那样好像就是细菌死掉了? 恩~我想经由大家的解答之後，我再试试看好了，希望能有比较高的浓度 谢谢大家!! --

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