※ 引述《bloodgas (奶油ˊ的梦)》之铭言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : : 有人用过从血液中抽出的cDNA做real-time PCR吗? : : 因为本身是用ABI的机器run real-time PCR... : : 但一直try不好PCR的condition... : : 不然就是有出来後...再做一次就没出来了... : : 且Ct值一值都满後面的...40上下... : : 所以一直做到没信心...>< : : 所以我想请问各位real-time PCR几个问题..以解笨小弟我的疑惑.. : : 1.real-time PCR做的时候,反应的量一定要加的很精准吗??? : : 2.ABI的real-time PCR是不是都不用设定annealing..这样一定都做的出来喔?? : : 3.因为我是用kit抽RNA,但是是用一般方法转cDNA..所以会有可能cDNA转的不好吗? : : 4.请问有人用invitrogen这家的kit抽RNA吗?...做後续效果都可做很漂亮吗?? : : 5.请高手帮我想一下我该怎麽办...谢谢... PCR有一个重要的公式 y=(1+e)^n e是PCR反应的效率,而n次方指的就是cycle number 就我所知real-time PCR,是希望每一个PCR反应能尽量达到 e=100% 所以才会限制产物大小 (<250 bp) 跟反应温度(2-step PCR) 当然对於template的要求也是非常的高 如果你的template quality不佳,做出来的结果常常会认你吐血 (我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差个1结果就差两倍,真的会吐血 观察国外这方面做的好的实验室,对於template的quality要求是严格到不行) 如果你都按照他的限制下去做,基本上他们是可以保证一定可以得到很好的结果 但是温度是绝对可以调整的 如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR还好,当然没有理由不调整温度 (这又牵涉到primer的设计,所以他们也出了一套软体专门帮你设计适合的primer) 只是你要确定这样条件下的e比他们条件下的e来的好 另外,反应体积也是要尽量精确,因为reagent里还有ROX dye, 机器会在判读时拿这个萤光作为不同well之间体积的校正 (但是怎麽校正我就不清楚了,有兴趣者可以自行测试,再来跟大家分享吗?) 不过一我的经验,差个1-2 micro-liter是影响不了多少啦!(我做25 micro-liter的) RT Real-time我也做过,用的是TRIzol抽的 OD 260/280实在不怎麽好(说来惭愧,1.6我就欢天喜地了) 但是也都做的出来 刚开始还傻傻的买他的one-step RT-PCR reagent(贵到爆) 後来也开是自己转(我用过BD以及invitrogen的kit) 但是结果仍然满意,所以抽RNA跟RT的kit应该是影响不大 反而是你操作的好不好的问题 另外你的反应做大於40 cycle,然後Ct只会在40以後出现 我也如bloodgas大大会建议你看一下internal control的Ct会在多少出现? 可以一并确认是quality的问题 或者你的基因表现就是低到不行 希望对你有所帮助 : 1.是的,要尽可能精准 : 2.我们实验室用的是Roche的机器,不过所有program的温度跟时间都可以调整,因为每一个 : 基因都不一样,同样的条件不可能适用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI机器 : 没用过,所谓的不能改条件意思是???? : 3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一样,quality没问题,reverse transcription只要没有 : RNase污染就没问题 : 4.要check RNA quality就直接跑个gel来看,28S/18S的band正确,比例也正确就可以 : 5.crossing point 40是太低了,应该就是没有东西吧...你测过抽出来的RNA的浓度吗? : 你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外, : 你做过house keeping gene的real-time PCR吗?这样可以直接确定你的cDNA有没有问题. : 还有一点就是可以加上一个positive control,plasmid或是PCR fragment,这样才能 : 确定至少real time PCR的过程没有问题.. : 以上 --

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