※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : ※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : : PCR有一个重要的公式 : : y=(1+e)^n e是PCR反应的效率,而n次方指的就是cycle number : : 就我所知real-time PCR,是希望每一个PCR反应能尽量达到 e=100% : : 所以才会限制产物大小 (<250 bp) 跟反应温度(2-step PCR) : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 请问一下...你说的这限制是针对於real-time吗? 是的,real-time PCR的产物大小是要限制在250 bp以下的 这个在设计primer的primer express软体里面已经内建好了限制 当然也有得改啦,不过有人做过超过300 bp以上的反应就已经不太好了 所以我的产物大小都控制在100-200 bp : 其实用kit抽,是怎麽抽都抽的出RNA....问题我想就如我那时ABI : 跟我说出在转cDNA,因为RT我并是用kit,而是各家厂商东奏西奏去转的... : 其实,我觉得不是操作的问题....操作的基本手则大家应该都一样, : 感觉问题不大... 嗯! 我所说的操作问题是指在转cDNA时候的细节之类的 不是说real-time的操作,因为上机实在没有什麽可以影响的了 : 其实我现在比较想知道,若是cDNA没转好,导致PCR做的出来而q-PCR做不出来.. : 除了重抽外,有啥补救措施....拜托各位高手(因为我的检体不太可能再重抽了..><) 你用多少RNA下去转cDNA? 然後应该有稀释5倍吧! 你的real-time PCR用了多少这样的cDNA去做呢?(有时下太多也会有问题喔) internal control是什麽? Ct又是多少? 因为你是用kit抽的,基本上如过连这些资讯得到的资料都没有问题的话 我想真的有点难救... --

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