※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : : 请问一下...你说的这限制是针对於real-time吗? : 是的,real-time PCR的产物大小是要限制在250 bp以下的 : 这个在设计primer的primer express软体里面已经内建好了限制 : 当然也有得改啦,不过有人做过超过300 bp以上的反应就已经不太好了 : 所以我的产物大小都控制在100-200 bp : : 其实用kit抽,是怎麽抽都抽的出RNA....问题我想就如我那时ABI : : 跟我说出在转cDNA,因为RT我并是用kit,而是各家厂商东奏西奏去转的... : : 其实,我觉得不是操作的问题....操作的基本手则大家应该都一样, : : 感觉问题不大... : 嗯! 我所说的操作问题是指在转cDNA时候的细节之类的 : 不是说real-time的操作,因为上机实在没有什麽可以影响的了 : : 其实我现在比较想知道,若是cDNA没转好,导致PCR做的出来而q-PCR做不出来.. : : 除了重抽外,有啥补救措施....拜托各位高手(因为我的检体不太可能再重抽了..><) 我的检体有两部分,一种病人,一种正常人,..起初是认为怕抽不太够... 我现在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部转,转的总体积约100ul 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼错..哈)的kit去抽,回溶100ul, 分三管去转,每管加30ul的RNA,每馆总体积都约100ul : 你用多少RNA下去转cDNA? 然後应该有稀释5倍吧!.. cDNA後来没有稀释5倍..但後来用正常人的cDNA有稀释10倍和100倍 但都做不出来 : 你的real-time PCR用了多少这样的cDNA去做呢?(有时下太多也会有问题喔 )cDNA,无论是稀释10倍会100倍都只加1ul,反应的总体机是10ul : internal control是什麽? b-actin Ct又是多少? 40上来.等於没有 : 因为你是用kit抽的,基本上如过连这些资讯得到的资料都没有问题的话 : 我想真的有点难救... 我目前还没拿病人的cDNA来做...real-time 我猜可能RNA农度太高了,但我pcr还是做的出来阿!! 因为起出是怕说太稀了!! 不然就是你说的...primer要做的size超过200吧..导致不好做 谢谢 --

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