※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : ※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : : 是的,real-time PCR的产物大小是要限制在250 bp以下的 : : 这个在设计primer的primer express软体里面已经内建好了限制 : : 当然也有得改啦,不过有人做过超过300 bp以上的反应就已经不太好了 : : 所以我的产物大小都控制在100-200 bp : : 嗯! 我所说的操作问题是指在转cDNA时候的细节之类的 : : 不是说real-time的操作,因为上机实在没有什麽可以影响的了 : 我的检体有两部分,一种病人,一种正常人,..起初是认为怕抽不太够... : 我现在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部转,转的总体积约100ul : 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼错..哈)的kit去抽,回溶100ul, : 分三管去转,每管加30ul的RNA,每馆总体积都约100ul : : 你用多少RNA下去转cDNA? 然後应该有稀释5倍吧!.. : cDNA後来没有稀释5倍..但後来用正常人的cDNA有稀释10倍和100倍 : 但都做不出来 : : 你的real-time PCR用了多少这样的cDNA去做呢?(有时下太多也会有问题喔 : )cDNA,无论是稀释10倍会100倍都只加1ul,反应的总体机是10ul : : internal control是什麽? b-actin Ct又是多少? 40上来.等於没有 : : 因为你是用kit抽的,基本上如过连这些资讯得到的资料都没有问题的话 : : 我想真的有点难救... : 我目前还没拿病人的cDNA来做...real-time : 我猜可能RNA农度太高了,但我pcr还是做的出来阿!! : 因为起出是怕说太稀了!! : 不然就是你说的...primer要做的size超过200吧..导致不好做 : 谢谢 不客气,大家一起讨论求进步喽~~ PCR需求比real-time PCR宽松很多, 请不要以为"PCR做的出来就一定没问题"比较好喔! 虽然说你的RT是东凑西凑kit做出来的 我想 你的RNA转cDNA这一步非常的奇怪喔! 你有测过RNA得OD260/280吗? 一般都是用1-2ug去转cDNA,反应最後体积是20ul 然後再加DEPC-H2O到100ul(就是我所说的5倍稀释.看来你跟我说的是一样的) 你这样转cDNA实在是太浪费RNA了啦! 不管你加了多少,reverse transcriptase按照protocol来能转的RNA就是1-2ug 多加只是浪费 我的template也是病人的血球细胞,3ml的全血抽出来的RNA就可以让我做好多次RT 再加上你说的internal control Ct也在40左右 (amplification curve一点都没有上升的趋势吧) 我认为是你下的template太稀了(但是10倍应该也只差3点多个cycle,100倍应该是差7) 然後再加上你的产物如果又大於200bp,你到底做多大呢?? (不过,连b-actin都大於200 bp吗?) 大概就是它不容易做出来的原因了 --

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