※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之铭言： : : 我的检体有两部分,一种病人,一种正常人,..起初是认为怕抽不太够... : : 我现在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部转,转的总体积约100ul : : 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼错..哈)的kit去抽,回溶100ul, : : 分三管去转,每管加30ul的RNA,每馆总体积都约100ul : : cDNA後来没有稀释5倍..但後来用正常人的cDNA有稀释10倍和100倍 : : 但都做不出来 : : )cDNA,无论是稀释10倍会100倍都只加1ul,反应的总体机是10ul : : 我目前还没拿病人的cDNA来做...real-time : : 我猜可能RNA农度太高了,但我pcr还是做的出来阿!! : : 因为起出是怕说太稀了!! : : 不然就是你说的...primer要做的size超过200吧..导致不好做 : : 谢谢 : 不客气,大家一起讨论求进步喽~~ : PCR需求比real-time PCR宽松很多, : 请不要以为"PCR做的出来就一定没问题"比较好喔! : 虽然说你的RT是东凑西凑kit做出来的 : 我想 你的RNA转cDNA这一步非常的奇怪喔! 你有测过RNA得OD260/280吗? : 一般都是用1-2ug去转cDNA,反应最後体积是20ul : 然後再加DEPC-H2O到100ul(就是我所说的5倍稀释.看来你跟我说的是一样的) : 你这样转cDNA实在是太浪费RNA了啦! : 不管你加了多少,reverse transcriptase按照protocol来能转的RNA就是1-2ug : 多加只是浪费 : 我的template也是病人的血球细胞,3ml的全血抽出来的RNA就可以让我做好多次RT : 再加上你说的internal control Ct也在40左右 : (amplification curve一点都没有上升的趋势吧) : 我认为是你下的template太稀了(但是10倍应该也只差3点多个cycle,100倍应该是差7) : 然後再加上你的产物如果又大於200bp,你到底做多大呢?? : (不过,连b-actin都大於200 bp吗?) : 大概就是它不容易做出来的原因了 谢谢......我了解可能就是做的长度太长... 那我想问一下......cDNA不纯有没有可能抑制real-time的表现 其实就是cDNA里头有剩余的dNTP或可能会抑制的buffer...有办法解决嘛?? --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 218.169.88.217 ※ 编辑: lakerjackt 来自: 218.169.88.217 (12/17 15:49)