作者ssuny (Cheer up!!!)
看板Biotech
标题[求救] cloning求救...一直做到怪东西阿
时间Wed Dec 27 20:18:30 2006
从事现在在clone的蛋白已经快2个月了...
一直没有好的结果...本人做到都快没信心了
请各位版友好心帮个忙吧...帮我看看到底是哪里的问题...
以下是实验步骤及结果
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1. 将pET32a以RE切开 并将目标基因从pCRII上切下
使用的RE为 Sal I 以及 Hind III
电泳图:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850536&p=0
最左边为marker, lane 1是切过的pET32a(5.9k), lane 2是切过的目标基因(~0.6k)
2. 切胶回收
电泳图:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850537&p=1
依序为marker,pET32a,targer gene
3. Ligation , 比例约为1:5
4. 抽plasmid以RE处理确认
分别以 Sal I 及 Hind III 处理, 可是跑完电泳後却是怪东西
电泳图:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850538&p=2
如图,4个sample切下来完全看不出来是pET32a,大小片段完全不对
看起来也不像是污染...Orz...
拜托大家给个建议吧...在这样下去小弟真的要换题目了 囧
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.208.29
1F：推 ROKEE:你的电泳图没标marker，怎麽看= = 12/27 20:35
2F：推 ssuny:唔..那我改一下好了...囧rz 12/27 23:14
※ 编辑: ssuny 来自: 211.72.204.94 (12/27 23:54)
3F：推 cyken:ligation的vector 放多少 (ng) ? 大概长多少colony ? 12/28 00:20
4F：→ cyken:有没有 control组？ 不是埋头苦干两个月就一定会成功， 12/28 00:22
5F：→ cyken:试着在每个步骤尽可能做positive and negative control 12/28 00:26
6F：→ cyken:这样才能找出问题所在。 12/28 00:28
7F：推 johnny853884:推楼上说的~~最近深深体会 12/28 11:23
8F：推 turtle24:原po要记得load个没切过的原vector & 切过的空vector 12/28 16:48