※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之铭言： : 从事现在在clone的蛋白已经快2个月了... : 一直没有好的结果...本人做到都快没信心了 : 请各位版友好心帮个忙吧...帮我看看到底是哪里的问题... : 以下是实验步骤及结果 我特别去查了一下pET32a plasmid map..... 我发现到一件事.....你可能要换restriction enzyme才能做出来..... 原因如下..... 在pET32a map上...Hind III的位置在第173bp而Sal I的位置在第179bp map上的序列如下: Sal I ------ ------------AAGCTTGTCGAC---------- ------ Hind III 你说你pET32a是用Hind III + Sal I cut 在此帮你建立一个观念.....邻近的两个enzyme最好不要一起用 因为当你其中一个enzyme作用时会导致另外一个enzyme无法作用 举例来说: 假设Hind III先作用 作用完後linear plasmid会变成以下情形 Sal I ------ -----A AGCTTGTCGAC-------- -----TTCA ACAGCTG-------- 之後,当Sal I准备要作用时, 请你注意一下 在Sal I cut site的左边(5'端)只剩下一个base pair 这种情形大多会影响下一个enzyme的作用力....严重的话会让他无法作用.... 所以, 你说你pET32a是用Hind III + Sal I cut...... 实际上, 却只是pET32a用Hind III or Sal I cut...... 你的clone一定会做不出来............ 你试着换另一种enzyme....两个enzyme距离远一点(至少要离3~6 base pair以上) 不同的enzyme所需要的距离也不同, 如何查到这种资讯? 你可以去翻NEB给的catalog...... 在最後的附录地方..给了很多restriction enzyme的information.... 包括在primer上加restriction enzyme旁边需要留多少base pair作用效果才会好... oligo-DNA上(例如linear plasmid)旁边要留多少base pair作用效果才会好... 等等...... 这些资讯都可以查的到....... ENB catalog是一本不错的工具书(对常做sub-cloning的人而言).... 对於你的问题....我相信你只要将其中一个enzyme换掉...应该就可以解决.... 希望你顺利.... Best..... --

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