※ 引述《mandible》之铭言： : PCR很多次了 : 还是P不出来 : 感觉primer dimer很明显? : 请问高手有哪些方法?可以教导我!! : 我的条件是 : 94度C-1mins : 45度C-2mins : 72度C-3mins : 跑36 cycles : pcr product大概是784bp(我知道很短)但是就是跑不出来! : 用的是taq proofreading enzyme (因为要送去定序) : 大概是这样!x 不知道你的primer设计多长? 不知道你有没有查过PCR原理的书籍..... 这里提供你一些建议: 设计primer时建议的长度是18~28mer左右 GC%最好在45~65% primer的3'端最好是C or G 因为会binding的比较紧..... primer设计的Tm值建议在60~65度C sense primer和anti-sense primer要注意会不会形成dimer或是自己形成hairpin... (这一项, 用软体去模拟....我用的软体是primer premier....) buffer中要有适量的Mg++....因为那是prolymerase活化所必需的东西.... dNTP不宜过量....因为过量的dNTP会抢走Mg++...反而使得polymerase活性降低.... 一般Taq ploymerase出错率约为1/10000 有proofreading功能的出错率约为1/100000~1/1000000 一般Taq ploymerase作用的速率约 1Kb/min 有proofreading功能的可能时间会长一点,估计1Kb/1.5min 有一些polymerase在做之前, 需要先进行HOT start (约95度C, 5~10min) (至於哪一些polymerase需要hot start, 要看你买哪一种enzymer决定.... 可以看catalog查询) PCR condition:(一般情况) 95度C 30sec--->denature 55~65度C 30~60sec---> annealing 72度C time---->extension (这里的时间, 取决於你的product size and polymerase种类) 言追正传....回到你的问题 首先, 我并不清楚你在设计primer时 是否有check过sense and anti-sense primer是否会形成primer dimer 以及你primer的长度, CG%, Tm值...... 所以, 依你所给的资讯而尽量提供你有用的意见: 第一, 你可以提高annealing温度,建议你先从55度开始试..... 如果可以的话...希望能能抓一下gradient Tm 从55度C抓到68度C..... 然後从中找一个温度...是PCR product产率最好的 也许你会问, 一开始annealing Tm到底要抓几度才适合...... 一般来说, annealing Tm的抓法是根据你从厂商那里得到的primer资讯 他会建议你Tm是多少, 然後再从他给的Tm降低5~10度C... 作为annealing Tm开始往上抓..... 一般而言, annealing温度不宜过低...... 温度过低除了容易形成primer dimer....也会降低primer的专一性..... 你的annealing Tm真的是太低了....建议你往上提高...... 第二, 由於你是要从cDNA钓出所要的gene..... 有时primer的设计就一定要这麽设计...偏偏又容易形成primer dimer 这时怎麽办? 有时, primer dimer的形成与sense, anti-sense primer两者的比例有关.... 如果一直有primer dimer出现, 建议你可以试一下primer浓度condition 像以下这样: 1倍 3/4倍 1/2倍 1/4倍 <---F primer的浓度 -------------------------------------------------------- 1倍 1 X 1 3/4 X 1 1/2 X 1 1/4 X 1 3/4倍 1 X 3/4 3/4 X 3/4 1/2 X 1 1/4 X 1 1/2倍 1 X 1/2 3/4 X 1/2 1/2 X 1/2 1/4 X 1/2 1/4倍 1 X 1/4 3/4 X 1/4 1/2 X 1/4 1/4 X 1/4 R-primer浓度 共16组condition 不过这种condition的目的是为了减少primer dimer情形..... 由於你连target DNA都没有做出来..... 所以不建议你这麽做.... 建议你先从annealing Tm值开始抓.... 希望你顺利 Best --

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