: 不知道你的primer设计多长? : 不知道你有没有查过PCR原理的书籍..... : 这里提供你一些建议: : 设计primer时建议的长度是18~28mer左右 : GC%最好在45~65% : primer的3'端最好是C or G 因为会binding的比较紧..... : primer设计的Tm值建议在60~65度C : sense primer和anti-sense primer要注意会不会形成dimer或是自己形成hairpin... : (这一项, 用软体去模拟....我用的软体是primer premier....) : buffer中要有适量的Mg++....因为那是prolymerase活化所必需的东西.... : dNTP不宜过量....因为过量的dNTP会抢走Mg++...反而使得polymerase活性降低.... : 一般Taq ploymerase出错率约为1/10000 : 有proofreading功能的出错率约为1/100000~1/1000000 : 一般Taq ploymerase作用的速率约 1Kb/min : 有proofreading功能的可能时间会长一点,估计1Kb/1.5min : 有一些polymerase在做之前, 需要先进行HOT start (约95度C, 5~10min) : (至於哪一些polymerase需要hot start, 要看你买哪一种enzymer决定.... : 可以看catalog查询) : PCR condition:(一般情况) : 95度C 30sec--->denature : 55~65度C 30~60sec---> annealing : 72度C time---->extension (这里的时间, 取决於你的product size : and polymerase种类) : 言追正传....回到你的问题 : 首先, 我并不清楚你在设计primer时 : 是否有check过sense and anti-sense primer是否会形成primer dimer : 以及你primer的长度, CG%, Tm值...... : 所以, 依你所给的资讯而尽量提供你有用的意见: : 第一, 你可以提高annealing温度,建议你先从55度开始试..... : 如果可以的话...希望能能抓一下gradient Tm : 从55度C抓到68度C..... : 然後从中找一个温度...是PCR product产率最好的 : 也许你会问, 一开始annealing Tm到底要抓几度才适合...... : 一般来说, annealing Tm的抓法是根据你从厂商那里得到的primer资讯 : 他会建议你Tm是多少, 然後再从他给的Tm降低5~10度C... : 作为annealing Tm开始往上抓..... : 一般而言, annealing温度不宜过低...... : 温度过低除了容易形成primer dimer....也会降低primer的专一性..... : 你的annealing Tm真的是太低了....建议你往上提高...... : 第二, 由於你是要从cDNA钓出所要的gene..... : 有时primer的设计就一定要这麽设计...偏偏又容易形成primer dimer : 这时怎麽办? : 有时, primer dimer的形成与sense, anti-sense primer两者的比例有关.... : 如果一直有primer dimer出现, 建议你可以试一下primer浓度condition : 像以下这样: : 1倍 3/4倍 1/2倍 1/4倍 <---F primer的浓度 : -------------------------------------------------------- : 1倍 1 X 1 3/4 X 1 1/2 X 1 1/4 X 1 : 3/4倍 1 X 3/4 3/4 X 3/4 1/2 X 1 1/4 X 1 : 1/2倍 1 X 1/2 3/4 X 1/2 1/2 X 1/2 1/4 X 1/2 : 1/4倍 1 X 1/4 3/4 X 1/4 1/2 X 1/4 1/4 X 1/4 : R-primer浓度 : 共16组condition : 不过这种condition的目的是为了减少primer dimer情形..... : 由於你连target DNA都没有做出来..... : 所以不建议你这麽做.... : 建议你先从annealing Tm值开始抓.... : 希望你顺利 : Best 不好意思, 再补充一点...是关於PCR做不出来的可能性........ 你应该是从某一个tissue抽取他的mRNA...然後转成cDNA...... 接着设计你所想要钓出的target DNA primer.... 然後去做定序......... 我之前的发言好像有一点转移了焦点....focus on primer dimer的形成..... 很抱歉, 没有回答你真正想要的答案...... 你的问题应该是为什麽做不出来...... 在此先向您说声抱歉...... PCR做不出来可能的情况: 第一, 完全没有任何band: 请先check 你当初抽取mRNA的tissue.... 是否真的有表达出你的target gene..... 如果是不会表现....那做在多次都不会作出来..... 为了厘清做不出来是因为primer的问题, 还是cDNA的问题... 建议你在做的时候加一组positive control...... 确定primer是可以work的............ 第二, 有做出band, 但是major band很弱...或是有很多杂band: 建议你上NCBI输入你的primer seq.去做blast.... check一下你的primer是不是很容易binding到其他gene上.... 如果primer的专一性不够好....建议你重新设计primer.... 希望你顺利..... Best --

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