※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之铭言： : 从事现在在clone的蛋白已经快2个月了... : 一直没有好的结果...本人做到都快没信心了 : 请各位版友好心帮个忙吧...帮我看看到底是哪里的问题... : 以下是实验步骤及结果 请问你纯化出来dna的体积是多少，你又load了多少体积的DNA? 1:5的比例我觉得是错的，因为从你的图看起来，insert跟vector的亮度差不多，但是 要记得，越大的fragment抓到的EtBr会越多，所以虽然看起来亮度差不多，dna的量其实 差很多。你应该要将亮度的比例除以分子量的比例。 举例来说，你的两个band看起来是1:1的亮度(insert:vector)分子量的比例，大约是 500:5000=1:10。这样一除，莫耳数比就大约等於1:0.1=10:1，也就是说，在相同体积 里面，insert的莫耳数是vector的10倍。所以，如果你要调到5:1(i:v)的话，取得体积比 应该是1:2 (i:v)。 所以你5:1(i:v)的比例是错的。你这样取，试管中实际的莫耳数比是50:1 (i:v)。 在这种情形下，过多的insert会与vector结合，这会造成一个vector与两个insert 结合，也就是说，用A enzyme切过的那端抓了一个insert，用B enzyme切过的那端也抓了 另一个insert，然後两个insert的另一端分别是A与B enzyme的切位，自然就接不起来。 在这种情形下，你挑到的菌应该就是随机乱接或是rearrangement的结果。看你只挑 了四颗，是不是因为只有长四颗呢？ 最後，看你的insert与vector大小的比例，1:5太多了，大概1:3就差不多了。1:5我记得 是当你的insert与vector大小差不多的时候才需要用到。 试试看吧，如果你原本就有除过分子量才去做ligation的话，就当我没说过罗～ --

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