唔...我的实验现在卡在蛋白质的expression和纯化已经有一段时间了... 我先说明一下现在实验的状况跟目的好了.... 希望有前辈能指点我过程是否有问题 我的实验是要将表现某蛋白质的基因transformation到E.coli 利用E.coli表现蛋白质 并纯化此蛋白质作为疫苗使用 蛋白质大小约48kD 表现载体为Promega的pGEMEX 利用T7 polymerase进行表现 E.coli strain 是BL21(DE3）...如果学长没说错的话... Induce 3hr後 收菌液离心 接着PBS重新悬浮後 用超音波破菌 离心 收上清液和沈淀 跑SDS-PAGE後 确定了我的蛋白质在沈淀中（inclusion body） 基本上到这里应该没甚麽问题... 因为我的蛋白质是单纯要打老鼠用的 暂不在乎蛋白质的folding正确与否 另外我希望能纯化出多量且较纯的蛋白质 所以我想直接纯化inclusion body来得到我的蛋白质 我在网路上收集一些纯化inclusion body的方法（都找到wash的方法..） 最後我用wash的方法作纯化 buffer成份为： buffer1：0.5% Triton X100; 50mM Tris-HCl pH8; 100mM NaCl; 0.1% sodium azide buffer2：成份一样 仅不含triton X100 步骤为：以buffer1再悬浮清洗pellet，离心18000Xg，20min，4度C 重复四次 再以buffer2洗过以去除triton X100，离心後保存pellet 原步骤最後会用8M Urea去溶pellet 可是当我这样作 之後SDS-PAGE跑出来结果非常的丑...而且根本不能判断结果... 所以我只用PBS冲起pellet就拿去跑SDS-PAGE （有99度煮过） 现在问题来咧.... SDS-PAGE的结果 我要的蛋白质的确还在 且明显的除掉了其他的proteins 但是...gel上却有两条bands 大小相近...我以7.5%的gel要跑到最底才分的明显... 估计应该46kD左右吧... 另外浓度都还蛮相近的（从染色上看来...） 我想了解另一条蛋白质是甚麽、会不会影响实验 才知能否利用这些纯化出来的蛋白质... 所以...一条是我的...另外一条约46kD左右...会是甚麽呢？@@ 会是E.coli的蛋白质吗？ 还是我的蛋白质folding的问题？？不过跑SDS-PAGE煮过应该不至於吧...?? 另外我考虑到的是vector的关系吗？ 还是整个纯化步骤少了些甚麽...？ 希望有经验或了解inclusion body纯化的人能指点我><" 或者可以提供其他纯化的potocol让我参考（wash或surcose gredient超高速离心法都可） 希望可以帮帮我!!如需要补充其他流程或状况的 我会在补充 在此先感谢了!! --

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