※ 引述《anchi (请给我胖老鼠~~~)》之铭言： : 我想要clone 人类chromosome上的某个基因, : 之後要接到retroviral的vector上, : 请问,有办法直接用设计两端primer方式,夹出这个基因吗? : (之前做细菌某基因的clone会用这个方法,不晓得是否可用在人类chromosome上?) : 还是,要用取出RNA做RT PCR 方式做出cDNA,再去接vector? : 另外,假设预计要用的vector是pSIR, : 若我想把上面的promoter换成另一个,要怎麽换? : 可以直接用restriction enzyme切下原本promoter区域, : 然後ligase欲换的promoter上去吗? : 这样,是不是还要确认nucleotide base数目是否有shift? : 第一次做这方面,请问大家, : 我这样的实验设计对不对,有没有错误需要修改或需要注意的事项? : 谢谢~ 你可以直接设计两端primer去夹 但是设计完的的primer请你上NCBI去做Blast 以及去UCSU去做预测, 看是否真的只会夹到你要的gene NCBI blast: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ UCSU PCR: http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr 如果都没问题...你应该可以直接用genomic DNA直接做 不过...请你考虑你要的target gene 在genome上是否有intron的存在...如果有intron... 建议你还是从cDNA开始钓吧 另一各问题, 关於promoter..... 如果我没记错....promoter应该是没有nucleotide base shift的情形... 所以...你如果想简单做...用酵素切一切接一接应该就可以了... 但是请注意...不是所有的promoter都适合拿来用 有些promoter需要enhancer或是其他element才能作用.... 你要考虑进去....... 不同的promoter距离start site的远近也不一样 基本上...一般常用的promoter都是经过测试过的 如果你要换promoter....你不仿参考这各promoter他们是怎麽设计的 你再考虑是否要这样做吧...... 愿顺利 BEST --

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