※ 引述《iceoo (醉心於巴黎)》之铭言： : ※ 引述《iceoo (醉心於巴黎)》之铭言： : : 请问一下 在用imidazole洗纯化之蛋白质的时候 : : 因为用1M imidazole去洗还是得不到我要的蛋白质 : : (用SDS-PAGE没压到 但pri-bind有压到) : : 所以就再提高imidazole的浓度 当提高到2M时 : : 在洗的过程中 带有Ni2+的 resin逐渐由绿色转为紫色 : : 请问是为什麽呢 我再用PBS wash後 又恢复成绿色了 : : thx! : 推 Bluecold:pH? 01/10 06:49 : 推 aggaci:没结合上去吧?通column前後，target protein量有改变吗? 01/10 14:19 : 推 wensing:用到1M imidazole相当高浓度！ 01/10 18:00 : → wensing:我只用300mM就可以洗下来了！ 01/10 18:01 : 推 alaric:你的cell extracts有表现? 01/10 21:27 : 谢谢各位的回答 应该有结合上去 我的蛋白质是可溶的 : 破菌後上清液(un-bind)是有表现的 菌液用column bind O/N後 流出来的液体(pri-bind : )target protein量有变少很多(coomassie和Western都一样结果 虽然很难 : 去估计pri-bind和un-bind load的protein是否等量) : 所以我推测应该是有bind 只是没冲下来...而且column为什麽会变成紫色呀 : 我有去找可是找不到答案 很诡异... 1M imidazole 下不来很不寻常 (且不合理) 用 0.5 M EDTA 把 Ni 懈下来吧.. 看 protein 有没有跑出来 再没有 0.1M NaOH wash 把 protein denature 下来吧 走到这一步 代表你protein 已 aggregate 在 gel 内 那你 condition 要改善... maybe 是 pH or ion strength Ni离子的确会随着配位数不同 是会从蓝绿--> 蓝-->紫色 --

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