作者Ezc (买东西不能对店家太客气!)
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标题[问题] 关於QIAGEN RNeasy kit抽tissue sample的问题
时间Thu Jan 11 01:57:47 2007
这问题困扰了小弟许久 不过到目前想破头仍然不知是为何
所以上来请教各位先进
最近得到了几组临床的tumor及邻近normal sample，并使用QIAGEN RNeasy kit
抽RNA来跑RT-PCR，不过发生了一个奇怪的问题，就是抽了四组，每一组的
tumor抽出来都是260/280於2.0~2.1，260/230於2.0以上，品质应该还不错
，跑RT-PCR也都很亮，但是每组抽Normal时，全部都抽不出来，用的
方法当然与抽tumor时一样的，神奇的是测OD时260及280全部是0.000…
因此想了几个原因
1 sample的RNA被degrade掉了：
每组都是normal及tumor同时处理，要degrade应该两个都抽不出来啊…?
2 tissue磨的不够碎：
已经尽全力磨碎了，但是就是tumor抽的好，normal抽不到
3 normal sample有问题：
应该不太可能四组都是normal有问题…?
4 抽的过程出问题：
不过已经完全遵照QIAGEN手册上一步一步做加上考虑Trouble shooting的最好做法
一样tumor好normal不好
其他有想过但觉得不太可能的原因
1 RNeasy kit放太久(四年以上)
membrane变质造成抽不出来，但是应该不会运气这麽好每次都是tumor用到好的…
2 normal含血造成RNA degrade
这个原因是唯一每组抽RNA时的共通点了，因为经由RLT lysis buffer+研磨棒+针筒
均质後，都是normal的均质液较红，而tumor较白，不过感觉有点没道理orz
另外用Trizol抽竟然也有相似的结果，normal sample的RNA抽是抽的出来，品质就是没有
tumor用trizol抽的好
(同重量normal 260/280~1.9，260/230~0.9 约3μg，tumor 260/280~2.0，
260/230~2.0 约30μg 差了十倍多orz)
希望有经验的先进能够指点一下 谢谢!!
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◆ From: 203.73.12.168
1F：推 OurNeverland:我以前也有碰到类似的情况 我觉得买新的kit吧 01/11 05:29
2F：推 asthma:有抽过clinical tumor tissue 都会遇到一样的问题 01/11 19:47
3F：→ asthma:不是reagent的关系 我好奇的是 实验室有经验的人应该告诉 01/11 19:48
4F：推 ginana:感觉像是SAMPLE本身的问题，确定sample是相同保存条件吗？ 01/12 09:56
5F：推 Ezc:保存条件都一样…都是取出後放RNAlater先4度一天再-80度保存 01/13 18:26