※ 引述《inspire0311 (每一天都值得庆祝)》之铭言： : 我已经做western blotting一个月了， : 结果一直出现这样的杂线? : 我问了学长，结果说我没有用TBS洗乾净， : 我自觉已经洗得很乾净了。 : 为何还是这样?请帮我看一下。 : 谢谢。 : 照片在这里: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=inspire0311&b=4&f=1902925055&p=0 首先请问你做的流程? 是曾经做过正常的western blotting 或一直都长这个样子? 我看了你的图 感觉是SDS PAGE 本身就没有跑好 你的蛋白很明显没有够清晰的分开。 虽然你的marker是有分开的， 但marker中的蛋白本来就单纯， 他有分开不代表PAGE本身的分离度是好的； 包括样品处理是不是ok，以及胶本身是不是ok 1.检查一下sample处理的过程中有没有问题。 加热时间够不够，温度有没有到， sample buffer要不要重配等。 我觉得你应该拿一些其他的来跑看看 随便收点细胞lysate来，看actin就可以了。 同时可以一起跑一点BSA(10-100ng即可)， 当做单一蛋白在你的样品处理方式下的参考。 首先要确认你整个实验方法是OK的， 再来看看是不是sample本身的问题。 2.PAGE本身凝结的不好，甚至Acrylamide生成就不是平均的网状架构 所以跑的都会歪歪的， 也有些蛋白会顺着做不好的地方一路残留， 产生你所谓纵向的线。 可以检查一下配方,同样的配方别人跑OK吗? 同样的配胶溶液人家跑OK吗? 凝胶时间是不是过长或过短? APS是否新鲜? Tris的ph值是否正确? 做一片好胶是很重要的。 3.跑电泳的时候是否温度过高? 电流值会不会过大?有没有可能因为过热而degrade? (不过感觉不太像) 4.你的sample中有什麽东西浓度很高吗? 在约40 kDa的地方有很明显的蛋白痕迹 而底下又有蓝色的呈色 不知那个位置是你的样品大小的地方吗 或其实可能是因为我上面说的40 kDa蛋白过多造成的non-specific binding 可能要判读一下讯号的真伪 因为我都是压片，没有做过直接膜上呈色， 这部分讯号的判读可能要请高手帮忙解答^^ 5.抗体本身是不是一只够好的抗体? 在你图中各处都有细小的点， 我认为那都是抗体的non-specific binding。 这跟你在做一抗的hybridize条件， 二抗的hybridize条件， 还有你wash的程度都有关系。 每只抗体的能力也不同,所以有可能要去测试找出最佳的用法。 包括titer、包括反应温度、包括时间； 有的抗体就是非四度 overnight不行， 有的抗体就是需要较高的tween 20来洗。 另,你是用TBS来洗 还是TBST洗? 既然叫做洗，就要有清洁剂喔。(不好笑，逃~) 加油罗! 其实满多地方可以抓抓看有没有问题的 祝你实验顺利:D --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 61.219.45.10