※ 引述《keiny (lav dolce vita(分生所))》之铭言： : Q1: 有大大做过这个实验吗? : 我想请教其中的细节 : Q2: 还是有其他更适合的方法 : (看unmodified form proetin 之 expression 情形) : {前情概要} : 小弟正在做这个实验(In vitro transcription & translation)中 : http://www.promega.com/pnotes/60/6079_07/promega.html : 目的: 要看在很少modification的环境下 : 我的protein的表现情形 : (注) 我是用S35-Met label 的 : 我要表现的DNA (约1800bp) construct在pet15b的vector中 : 因为它有T7 promoter : 手边又刚好有 : http://www.genomex.com/vector_maps/pet15bm.pdf : {惨状} : 不过我照着protocol做了几次 压了几次片子 : 都没有看到我想看的protein !! : 只有一些background band(compare with control:没有放入任何DNA的Reaction !!) : 恳请诸君给予建议 : 感激不尽~~~~ Q1: 我之前用过 Promega TNT Quick coupled transcription/Translation systems 做过(不知你用哪个,不过原理应该差不多 ),也是透过T7 promoter, 用35S-Met labeled,效果还不错. 没有得到你要的 protein 其实要 debug 的地方还蛮多的. 以上叙 Kit 为例: a. 如前人所提的, Kit 是否有问题, 应该先用 Kit 附的 control plasmid 做看看. b. Kit 是否保存於 -70 度, 因为 Kit 中附的 master mix 对 CO2 sensitive, 所以不要用乾冰保存. c. Kit 中附的 master mix 是否有重覆解冻过, 建议不要重覆解冻, 用不完就丢了. d. 你的 DNA 中要有 start codon 及 stop codon. e. DNA template 的量是否适当, 建议 1 ug (0.2~2 ug 也可),太多太少都不好. f. 避免 RNase contamination, 应以操作 RNA 的方式进行 (RNase-free). g. Master mix 用手温快速解冻, 再置於冰上使用. h. 反应的温度是否保持在 30 度, 太高太低都会影响反应. i. 可提高 Mg2+ or K+ 浓度, 增加反应的效率,如加 1~3 ul Kit 所附的 T7 PCR enhancer. j. 避免 Reaction 中有 Ca2+, 因 Ca2+ 会活化一些 nuclease, 造成 DNA template or mRNA degradation. k. DNA template 中若有 EtOH 残留会抑制 translation. Q2: 其实这方法是 In vitro 的, 对於你要看 unmodified protein expression 的实验目的似乎不太恰当,protein expression 受很多因素影响, 表现多表 现少都是 artificial 的 (而且你用的是 T7 promoter,而非原 gene 上的 promoter), 另外,我猜你指的 modification 应该是 post-transcription modification 吧, 若是 post-translation modification 应该跟此 protein 的 expression 较没有关系吧. 至於其他的实验方法我就不清楚了, 不过 我也很想知道, 希望有其他专家来教教我们. --

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