小弟我现在在帮老板做cloning 流程是这样的: 先将一段老板设计的约100bp的小片段insert接进vector A中 再transform到细菌中放大 将plasmid抽出 把insert切下来 再将insert接进vector B中 (protein expression vector) 然後将protein表现出来 现在遇到的困难是在抽plasmid的这一步一直无法突破 我用TB养菌 (6ml,280rpm 24hr 或 1ml LB 3hr再倒到50ml TB, 20hr) 用传统方法做plasmid maxi-prep 做了许多次 抽出的DNA量都不多 若是以回溶在200ul TE中来看 以OD260估计浓度最多约200ng/ul (也就是说稀释200倍去测OD260不到0.1 根本不准) 但是不管如何260/280 ratio 总是保持在1.8~1.9之间 若是以”跑电泳和marker比较亮度”来估计浓度的话则会更少 不到100ng/ul Lab中其他人使用同样方法的经验都可以抽到总量100~200mg的DNA 对於我抽maxi的量跟抽mini差不多都十分惊讶 我不知道在操作上到底有何问题 学姐也有全程监控过 并且也曾和我一起做过 学姐抽出来的量有比我多一点点 但还是很少 她也不知道问题在哪 我有想过: 1. 下次养菌的时候将抗生素Ampicillin由50ug/ul提高到200ug/ul 以增加plasmid数 2. 其实我手边insert有两段 两段序列不同但流程一样 每次抽maxi的结果其中一种的DNA量总是会比另一种多个2~3倍 自从我发现这个现象後就觉得养菌的结果好像也是一瓶比另一瓶稍浓一些 (不晓得是不是心理作用) 我想这会不会是接进了insert的plasmid对细菌有toxic effect之类的 或是不晓得什麽原因使copy number降低 而其中一种insert的影响比另一种来得明显? 我之所以会怀疑是insert造成的影响是因为Lab中的其他学长姐也做过 同样的实验流程 用同样的vector 只有insert和我不同 对於我的猜测不知道版上各位强者大大有没有什麽建议及批评?? 麻烦各位了!! m(_ _)m --

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