作者allisa (小晴)
看板Biotech
标题Re: [问题] 关於一个protein alpha-synuclein
时间Thu Feb 8 00:09:25 2007
※ 引述《allisa (小晴)》之铭言：
: 这个蛋白我做western一直都压不出来
: 看卖抗体的网页 也没有他试做的片子
: 想问问 有没有人压出来过?
: 是不是特别难压?
: 还是他表现量原本就很少?我的protein需要浓一点阿?
: 谢谢
我的步骤
我其他的蛋白都压得很正常 只有这个蛋白一直压不出来
跑胶的时候 上胶12% 下胶6%(这有点忘了) 不过都跟实验室其他人是一样的
110V 120min 之後transfer用400mA 65min
blocking的牛奶用1.25g泡25ml(一片胶的用量) 室温摇一小时
一抗我是用1:1000(用PBS稀释) 4度C overnight
之後用1X PBST洗5min*3
二抗是用0.5g泡10ml的牛奶加4ul抗体(抗体原液先用甘油1:1稀释抗冻过)
摇一个小时 室温下 之後用1X PBST洗5min*3 + 10min*3
接着使用ECL压片
大致上的步骤是这样 谢谢
然後说明一下压不出来的情形
是整张membrane压出来都很空白
只有在分子量很大的地方 大约50~60有一条明显的band
但是我要压的synuclein应该只有14左右
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.145.91
1F：推 NKTcell:可以押出东西 那过程应该没问题吧 可能你的sample原本就 02/08 03:58
2F：→ NKTcell:没alpha-synuclein 要不然就是抗体的问题了 02/08 03:59
3F：推 alaric:可以考虑transfer时间加长.. 02/08 19:03
4F：推 allisa:为什麽会建议transfer时间加长呢? 那电流要改吗? 谢谢 02/08 22:33