※ 引述《philesazumi (苦闷阿)》之铭言： : ※ 引述《willie0208 (我不要现在就出征....)》之铭言： : : 我有一段约4kb的vector要跟一段约2.4kb的insert接起来 : : 两个plasmid两端的切位分别用NotI和NcoI照理说应该很好接 : : 但是我做了两三个月了~还没做出来~ : : 问题到底出在那~涂盘後我的control组没长(有加ligase怕自接) : : test组长个两三颗~挑出来抽DNA後在去用相同的酵素切 : : 却跟原本vector的DNA一样大~ : : 到底是什麽原因???有大大可以救我吗?? : 1. 你如何判断insert确实有切？ : 2. insert如何来的？ : 3. 有几个control，两个吗？（有切，没加ligase;有切，有加ligase） : 4. 最後用相同的酵素切，如果你是要接入 MCS site : 当然跟原本的vector差不多一样大阿 : 你要看有没两条band吧（4kb & 2.4kb）！！！ : 5. 换不同切位，差异性大的（假设primer设计没问题的话） : 6. 先做TA，再sub- clon到你要的vector 首先, 问的问题还是像前面一位一样...请问...你的insert是怎麽来的?? 第一, 如果是从其他plasmid上切下来....那你应该可以check酵素的作用能力如何 这应该比较没问题............... 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出来.... 那你的primer上应该会有加Not I, Nco I cut site 请问在你这些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? (比较保险是加4各base, 但不同的enzyme需要的base数目也不同) 再来问vector的问题..... 请问...你的vector是用哪一种的?? NotI和NcoI是不是邻近的俩各cut site?? 你是否能确定你的vector作用很好?? 由於你所提供的作法和资讯太少.... 我们无法很精密地帮你找出问题的所在....只能靠猜测.... 我想....应该不是你vector的问题..... 主要原因应该在你的insert上.... 如果可以的话...希望你能写的详细一点...方便大家讨论.... --

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