※ 引述《werthers6925 (...)》之铭言： : ※ 引述《philesazumi (苦闷阿)》之铭言： : : 1. 你如何判断insert确实有切？ : : 2. insert如何来的？ : : 3. 有几个control，两个吗？（有切，没加ligase;有切，有加ligase） : : 4. 最後用相同的酵素切，如果你是要接入 MCS site : : 当然跟原本的vector差不多一样大阿 : : 你要看有没两条band吧（4kb & 2.4kb）！！！ : : 5. 换不同切位，差异性大的（假设primer设计没问题的话） : : 6. 先做TA，再sub- clon到你要的vector : 首先, 问的问题还是像前面一位一样...请问...你的insert是怎麽来的?? : 第一, 如果是从其他plasmid上切下来....那你应该可以check酵素的作用能力如何 : 这应该比较没问题............... : 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出来.... : 那你的primer上应该会有加Not I, Nco I cut site : 请问在你这些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? : (比较保险是加4各base, 但不同的enzyme需要的base数目也不同) : 再来问vector的问题..... : 请问...你的vector是用哪一种的?? : NotI和NcoI是不是邻近的俩各cut site?? : 你是否能确定你的vector作用很好?? : 由於你所提供的作法和资讯太少.... : 我们无法很精密地帮你找出问题的所在....只能靠猜测.... : 我想....应该不是你vector的问题..... : 主要原因应该在你的insert上.... : 如果可以的话...希望你能写的详细一点...方便大家讨论.... 不好意思,之前写得浅了 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector vector为pET23a 已接有另一段约1.4kb的基因 insert已经接到另一TA vector上 为pTZ57R/T 目前是用RE切出insert 由於plasmid的浓度高 所以在gel extraction前 可确定在约100b.p.附近有一粗亮的band competent cell也已确定无问题 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 125.232.147.245