※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : 我想要将一段只有50初b.p.的tag : 接到一个约5kb的vector上 : 想要请问一下 有没有人做过类似的实验 : 可以告诉我insert与vector间的molar ratio大概是多少 : 我已经试过许多比例了...@@ : 谢谢大家 请问...你是做不出来? 还是在做之前先问清楚比例?? 我之前有做过类似的clone 我是将一段linker(约40bp)接到plasmid上, 并且是oligo合成之後用RE切 老实说, vector和insert的比例根本不重要.... 只要把握一个要点....insert的分子数>>vector的分子数就行了 如果你一直做不出来...我就根据我的经验帮你作推测.... 你说你的insert已经在TA vector上了...然後用RE切完跑完GEL可以看到band 所以...RE的作用很好.... 因此...问题出在你从GEL中纯化出DNA这各步骤 由於你的insert只有50bp...非常小 你的insert跑完gel後...接下来的步骤就是切下gel... 加上你要用来纯化DNA Kit的buffer....然後放到65度C将gel溶解 问题就出在65度C煮的过程..... 因为你的insert只有50bp...在65度C的环境中...他有可能会部份denature... (想像一下PCR的原理, 应该很容易了解) 我之前做这各类似的CLONE一直做不出来的原因就是在此... 因此, 改良的作法是..... 当你加入BUFFER时....请不要放到65度C去煮你的GEL.... 请在室温下....不断拍打你的tube (一般而言, gel + buffer in 65度C环境....大约5分钟左右会将gel溶解.... 在室温下....约要30~60分钟) 在室温下溶解你的gel...可以确保你的DNA部会denature.... 等到gel溶解後...就照一般程序去纯化你的insert.... 然後做ligation..... 至於比例....不用太在意....只要你insert够多就行了..... --

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