作者ad1980 (Apoptosis)
看板Biotech
标题[问题] Lipofectamine 2000
时间Tue Feb 13 15:59:09 2007
我查了了，我transfect的时候照说明说书上的，
cell confluency ~ 90-95%
6-well tray: DNA 3ug, Lipofectamine 4ul,
用的medium 是 Opti-MEM，
隔天看，细胞是没有死很多，可是因为我是用GFP-tagged的，
在显微镜下，可以看到只有大概20%有GFP signal...
我只有incubate 24 hrs at 37C，
不过expression 应该24小时就够了吧？！
试了几次，最好的也只有50% efficiency...
有用过的版友都是一用就达到说明书上的
80-90% transfection efficiency 嘛？
所以想请教一下，是我忘了注意什麽重要的细节嘛？
顺便想请问一下，如果DNA放太多，会不会造成细胞怪怪的阿？
因为我看有GFP signal 的细胞，nucleus 都是 weird shape，
正常的细胞核都没有GFP signal...@@..
这让我很confused,
不知道那些有GFP signal 的细胞是真的有成功transfected的吗？
先谢谢了。
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梦想和现实是有距离的。
一切都将重新开始....
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◆ From: 64.180.57.97
1F：推 ivyshuang:看你是什麽cell,不同Cell line的effeciency会差很多喔~ 02/13 16:06
2F：推 zafirlukast:慢慢练罗...我也是一直进步.但是还是没到说明书上的值 02/14 01:16
3F：推 bee:DNA 对 Lipo 的 ratio 很重要....我们平常用的比例 1:4 02/14 01:33
4F：→ bee:你可以考虑看看这个比例......有进去的话24小时足够看到你要的 02/14 01:34
5F：推 Euronymous:1:4?请问一下你们计量DNA的单位是什麽? 02/14 22:52
6F：推 lytic:如果你欲表现的产物较大.使可以考虑延长表现的时间. 02/14 23:01
7F：推 bee:1 ug DNA 对 4 ul lipo 最多一个well 不超过 2 ug DNA 02/15 04:24
8F：推 ad1980:我是用HeLa和vero，感觉HeLa的efficiency比较好。 02/15 12:21
9F：→ ad1980:我最近是的比例是3:4，看起来，我好像用太多了？ 02/15 12:23
10F：→ ad1980:DNA太多反而效果会不好嘛？ 02/15 12:26
11F：推 ad1980:很感谢大家的热心回答，我再试试看。 02/15 12:28
12F：推 Duckhunter:80-90%~原厂说明书看看就好~有PAPER证明较重要 02/15 23:34
13F：推 bee:DNA 太多当然不好....效率不升反降喔...但是这个东西有时候不ꐠ 02/16 02:20
14F：→ bee:一样的plasmid 跟不同的细胞条件不会一样 02/16 02:20
15F：→ bee:Hela 1:4 肯定够了 02/16 02:21
16F：推 Vienne:我用过293T cell line,效果还不错 DNA的确不能加太多 03/30 14:29