作者baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)
看板Biotech
标题[求救] cloning~~~cloning~~
时间Wed Feb 14 22:18:54 2007
想请问大家CLONING~~~拜托拜托~~~
做好几个月了~~还是弄不出来~~
我的insert约1.8kb~~在PRIMER上设计BamHI 与 SmaI切位
後来实在没办法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC)
我使用的VECTOR有6.8kb
後来做SUBCLONE还是接不进去~~
GEL EXTRACTION的KIT是用慧众的~~
看图是都有切但是就是接不进去
有可能是酵素乱切吗?!BUF坏掉吗~~???!!!!
呜呜~~~求救~~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.60.28
1F：推 Ackbar:TA 接进去了? 02/14 22:29
2F：推 baca:嗯嗯对阿~~我在PCR产物後加A~~用TA的KIT接近去了~~ 02/14 22:35
3F：推 Ackbar:那你确定你subclone用的vector接点跟你的insert两端互补吗 02/14 22:40
4F：推 baca:我用vector切位也是BAMHI跟SMAI两沏位邻近 02/14 22:42
5F：推 kirry:蝴蝶牌的Sma I的限制酵素切割的温度为25度喔 这点有注意到吗 02/14 23:13
6F：推 baca:有～～水浴25切 02/14 23:33
7F：推 kirry:你接在TA vector上 可个别切一刀 试试看是否是buffer或是限 02/14 23:37
8F：→ kirry:制酵素的问题..还有你的DNA浓度呢 02/14 23:39
9F：推 baca:切一刀都没问题～～我用2500ng去切insert 02/14 23:42
10F：→ kirry:切完後 纯化的浓度呢 02/14 23:46
11F：推 baca:在ＴＡ上ㄉＩＮＳＥＲＴ切下来2刀下来後剩385ng 02/14 23:50
12F：推 cplinn:你所谓接不进去是什麽样的状况? control 和 ligation 的 02/15 02:31
13F：→ cplinn:transformant 一样多? 还是比较多但找不到正确的 clone? 02/15 02:31
14F：→ core308:你的vector够纯吗 将其纯化再用限制酵素作用看看 02/15 09:15
15F：→ core308:另外可以的话两刀分开切(vector) 02/15 09:16
16F：推 baca:我的transformants满多的~~淡没有做VECTOR ONLY的CON~~~ 02/15 09:52
17F：→ baca:我是先沏SMAI再沏BAMHI~~~ 02/15 10:09
18F：推 cplinn:vector only 是绝对必要的 可能你得到的都是 self-ligate 02/15 13:32
19F：→ cplinn:看来还是 vector 处理的问题 下次接时用「少很多」vector 02/15 13:34
20F：→ cplinn:再接接看 还有记得补上 vector only 02/15 13:35