作者Shamino (万年猪)
看板Biotech
标题[问题] 请问抽取yeast plasmid
时间Wed Feb 14 22:42:11 2007
最近在做抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli
不过抽取yeast plasmid 总是抽的很不稳定,
transform 至E.coli的 plate colony几乎不会长或是极少( n < 5 )
因为市售的kit很贵
试了molecular cloning中的方法觉得很难用之後
从网路上找到了两种prtotocol
http://www1.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf
跟
http://www.med.unc.edu/~hdohlman/plasmidisolation.html
这两种都是用 mini-prep 的方法 再加入 beads 来抽取yeast的 plasmid
不过这两种方法还是很不稳定, 失败率还是很高
目前是已经先行排除後续trasformation的问题(非 competent cell, plate 等)
也并非yeast cell来源的问题( 同一株yeast 接出来抽,时好时坏)
而小弟的方法流程就跟上面的protocol一模一样,两种都试过,都时好时坏
想请问有先进是用类似方法做的很稳定又好的吗?
希望有任何可以指点小弟的地方
感谢再先呀
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.139.222.8
1F：推 kirry:抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli ??这是? 02/14 23:32
2F：推 freesoul:是yeast 2 hybrid後续要拿candidate出来吗? 02/15 02:40
3F：推 cplinn:有什麽奇怪 amplification 用啊 02/15 02:40
4F：→ freesoul:假如是这样的话我的经验是PCR送sequence後问有没有人有 02/15 02:41
5F：→ freesoul:还比较快...XD 02/15 02:42
6F：推 angelhunter:我的经验是要用电菌的 效率差很多 可能是plasmid太脏 02/15 09:25
7F：推 ROKEE:我猜原po可能为了要定序吧 02/15 12:20
8F：→ ROKEE:如果真的如我假设,那乾脆加热破yeast後直接拿crude extract 02/15 12:20
9F：→ ROKEE:做heat shock送E. coli就好，还是会长...... 02/15 12:21
10F：→ ad1980:我前辈试过，据他的经验用heat shock transform 出来真的很 02/15 12:29
11F：→ ad1980:很少，建议用electroporation，efficiency好很多，真的。 02/15 12:30
12F：→ ad1980:我做Y2H的时候也是要抽，但我是用electroporation， 02/15 12:32
13F：→ ad1980:完全没有这个问题...所以可以试试看。 02/15 12:33
14F：推 tin0101:去买genemarl plasmid kit 很便宜. 02/15 13:06
15F：推 ROKEE:crude extract没办法用电的,一定会爆给你看XDD 太脏了... 02/15 13:12
16F：→ ROKEE:我连ligation product都会爆炸 @_@ 非得先纯化才行 02/15 13:13
17F：→ ROKEE:而且heat shock送E. coli效率绰绰有余,又比用电的方便很多 02/15 13:13
18F：推 Shamino:感谢各位提供不少意见:)这几天小弟会再试试:) 02/15 14:51