※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之铭言： : 想请问大家CLONING~~~拜托拜托~~~ : 做好几个月了~~还是弄不出来~~ : 我的insert约1.8kb~~在PRIMER上设计BamHI 与 SmaI切位 : 後来实在没办法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC) : 我使用的VECTOR有6.8kb : 後来做SUBCLONE还是接不进去~~ : GEL EXTRACTION的KIT是用慧众的~~ : 看图是都有切但是就是接不进去 : 有可能是酵素乱切吗?!BUF坏掉吗~~???!!!! : 呜呜~~~求救~~~ : _ 由於你给的资讯很少, 因此就你所给我们的资讯, 我们也很难正确的帮你判断你真正的问题出在哪里..... 顶多只能告诉你该做什麽control, 该留意什麽事情.... 如果可以的话, 不知你是否愿意写的详细一点.... 包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麽名称? vector是用哪一家牌子?叫是什麽名称? (这样方便我上网找出map, 进而判断在vector上的cut site是否选取恰当,有问题) 最好是能把实验流程写一下..... RE怎样作用?在什麽温度?用什麽buffer? 怎样纯化DNA?用什麽方法?什麽KIT? 您写的越详细, 我们才能精确的帮您判断可能发生问题的因素..... 言归正传......根据你所给的资讯....而加以推论..... 你的insert最出是用PCR的方式做出...并且primer上加上BamHI and SamI.... -->做不出来!! (可能是由於primer上5'端没有额外加base所造成) 之後, 你将insert接在TA-vector上.... 并且先用SmaI再用BamHI切..... -->仍然做不出来!! (因为insert已经接在TA-vector上..就和primer上5'端有无额外加base已经无关... 推翻先前假设.....) 先用SmaI切, 假设你是用NEB的RE.... SmaI是用NEB buffer4..... 就算你没有换buffer直接加入BamHI作用.... BamHI在buffer4的作用活性也有75%..... 因此RE在insert上的作用应该很好........ 接着看vector的作用能力..... 你说你的transformant colonies长的很多, 但很可惜没有做vector的control.... 由於你的colony长很多...但却没有一各是你要的clone.... 因此就可以直接看成是vector的control.... (虽然不知道挑出来的是vector only还是杂菌.....) 也就是说.....你的vector作用不好...... 你的问题....应该是出在RE作用在vector这各地方..... 至於原因为何? 由於您给的资料很少....所以无法判断..... 以上小弟推论.....不知有无帮上忙.... --

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