作者baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)
看板Biotech
标题Re: [求救] cloning~~~cloning~~
时间Thu Feb 15 18:06:36 2007
※ 引述《werthers6925 (...)》之铭言：
: ※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之铭言：
: : 想请问大家CLONING~~~拜托拜托~~~
: : 做好几个月了~~还是弄不出来~~
: : 我的insert约1.8kb~~在PRIMER上设计BamHI 与 SmaI切位
: : 後来实在没办法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC)
: : 我使用的VECTOR有6.8kb
: : 後来做SUBCLONE还是接不进去~~
: : GEL EXTRACTION的KIT是用慧众的~~
: : 看图是都有切但是就是接不进去
: : 有可能是酵素乱切吗?!BUF坏掉吗~~???!!!!
: : 呜呜~~~求救~~~
: : _
: 由於你给的资讯很少, 因此就你所给我们的资讯,
: 我们也很难正确的帮你判断你真正的问题出在哪里.....
: 顶多只能告诉你该做什麽control, 该留意什麽事情....
: 如果可以的话, 不知你是否愿意写的详细一点....
: 包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麽名称?
: vector是用哪一家牌子?叫是什麽名称?
: (这样方便我上网找出map, 进而判断在vector上的cut site是否选取恰当,有问题)
: 最好是能把实验流程写一下.....
: RE怎样作用?在什麽温度?用什麽buffer?
谢谢各位~~^____________________^我找出原因了~~
居然是我家的BAMHI BUF坏掉~~~
所以一直切不好~~~接不进去
: 怎样纯化DNA?用什麽方法?什麽KIT?
: 您写的越详细, 我们才能精确的帮您判断可能发生问题的因素.....
: 言归正传......根据你所给的资讯....而加以推论.....
: 你的insert最出是用PCR的方式做出...并且primer上加上BamHI and SamI....
: -->做不出来!! (可能是由於primer上5'端没有额外加base所造成)
: 之後, 你将insert接在TA-vector上....
: 并且先用SmaI再用BamHI切.....
: -->仍然做不出来!!
: (因为insert已经接在TA-vector上..就和primer上5'端有无额外加base已经无关...
: 推翻先前假设.....)
: 先用SmaI切, 假设你是用NEB的RE....
: SmaI是用NEB buffer4.....
: 就算你没有换buffer直接加入BamHI作用....
: BamHI在buffer4的作用活性也有75%.....
: 因此RE在insert上的作用应该很好........
: 接着看vector的作用能力.....
: 你说你的transformant colonies长的很多, 但很可惜没有做vector的control....
: 由於你的colony长很多...但却没有一各是你要的clone....
: 因此就可以直接看成是vector的control....
: (虽然不知道挑出来的是vector only还是杂菌.....)
: 也就是说.....你的vector作用不好......
: 你的问题....应该是出在RE作用在vector这各地方.....
: 至於原因为何?
: 由於您给的资料很少....所以无法判断.....
: 以上小弟推论.....不知有无帮上忙....
--
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◆ From: 140.112.60.28
1F：推 Bluecold:这理由...好....囧 02/15 20:43
2F：推 a64toto:请问是如何知道buffer坏掉的? 02/15 20:49
3F：推 Crow22312:跟隔壁家借? 02/15 20:57
4F：推 baca: 其实我是一样一样换新的~~原本也想说不可能是BUF有问题~~ 02/15 22:55
5F：→ baca:後来隔壁实验室的学长帮我是一个东西都用他家的除了BAMHI buf 02/15 22:56
6F：→ baca:不过也是刚好那时他找不到他家的BAMHI BUF所以只有BUF是긠 02/15 22:58
7F：→ baca:我家的~~~结果也是TRANSFORMANTS很多~~但挑不到~~ 02/15 22:59
8F：→ baca:於是我把BAMHI BUF换新的~~~结果十个有八个是~~ 02/15 23:00
9F：→ baca:所以才知道是BUF的问题~~~我想是BUF有问题造成STAR ACTIVITY 02/15 23:02
10F：推 ebiyaya:这也太神奇了吧~~总之恭喜做出来了 ^^ 02/16 22:17
11F：推 sssos:可是你之前不是说切一刀都没问题? 哈，总之恭喜。 02/26 22:39