如题 请问板上有做过带有6 his-tag fusion protein纯化的大大 在从column上elute蛋白的时候 是用多少imidazole浓度的elute buffer去elute的? 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute 但似乎没有elute出来 而查纯化的书 上面写在某些case中 要用250 mMimidazole浓度的elute buffer去elute 因此想问问大家是否有用如此高浓度imidazole浓度的elute buffer去elute的经验 如上述所题 小弟这次的纯化没有成功 因此也考虑fusion protein存在於inclusion body中的可能性 在lysate(BL 21)离心(11000rpm 30min 4度c)之後 观察到存於离心管管壁上的pellet非常难用水洗掉 加普通的detergent也洗了半天才洗掉 而以之前纯化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的经验(同样都是100ml culture) 在lysate离心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不会难洗 因此在此才推论fusion protein存於inclusion body中的可能性 p.s. 在此之前我有先进行一次1ml culture的test实验 结果我要的fusion protein的确是存在於supernatant之中 在此也顺便请问一下板上高手们 什麽情况下会形成inclusion body? 我在一本纯化的书中看到culture size会影响 所以我推测这是fusion prtein从原本test显示的supernatant中跑到inclusion body原因 不知这样是否正确? 而我也想请问大家这样会形成inclusion body的原理是什麽? 还有也请问大家 离菌或离lysate时的温度会有造成inclusion body形成吗(我都用4度c)? 又如果把经IPTG induce之後的菌液冰到4度c三个小时後再处理(lyse) 也会造成inclusion body形成吗? 问了一堆问题 希望有经验的前辈们给我一些指示~~~ 谢谢 --

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