※ 引述《yffurdyeknom (Unhurried Justice)》之铭言： : 如题 : 请问板上有做过带有6 his-tag fusion protein纯化的大大 : 在从column上elute蛋白的时候 : 是用多少imidazole浓度的elute buffer去elute的? : 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute : 但似乎没有elute出来 : 而查纯化的书 : 上面写在某些case中 : 要用250 mMimidazole浓度的elute buffer去elute : 因此想问问大家是否有用如此高浓度imidazole浓度的elute buffer去elute的经验 175mM 如果洗不出来 有几种可能 第一个他的结合力太强......这种可能性不大但不是没有 His-tag 有一个特色其实你用到100 mM imidazole 就会开始有些蛋白开始洗出ꠊ只是量很少 第二个 我曾经用到　500　mM imidazole 没有问题 第三 你的蛋白根本没有结合到管柱上面去 可能是过柱的条件不对或是你的蛋白根本就没出来 过柱的时候把每一个fraction 都收一点 一起跑胶确认你要的东西跑到哪里去 : 如上述所题 : 小弟这次的纯化没有成功 : 因此也考虑fusion protein存在於inclusion body中的可能性 : 在lysate(BL 21)离心(11000rpm 30min 4度c)之後 : 观察到存於离心管管壁上的pellet非常难用水洗掉 : 加普通的detergent也洗了半天才洗掉 : 而以之前纯化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的经验(同样都是100ml culture) : 在lysate离心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不会难洗 : 因此在此才推论fusion protein存於inclusion body中的可能性 : p.s. 在此之前我有先进行一次1ml culture的test实验 : 结果我要的fusion protein的确是存在於supernatant之中 : 在此也顺便请问一下板上高手们 : 什麽情况下会形成inclusion body? : 我在一本纯化的书中看到culture size会影响 : 所以我推测这是fusion prtein从原本test显示的supernatant中跑到inclusion body原因 : 不知这样是否正确? 这是一种可能 其实这一点很容易确定 每次做大量培养诱导蛋白产生时 除了大瓶收下来以外 你也可以同时收个小量 先做确认 当然会多花一点时间跟功夫 但是至少不会做到後来甚麽蛋都没有 就算失败也至少可以知道问题出在哪里 : 而我也想请问大家这样会形成inclusion body的原理是什麽? : 还有也请问大家 这太复杂 自己看一下书 : 离菌或离lysate时的温度会有造成inclusion body形成吗(我都用4度c)? 没听说过 也不太可能 inclusion body 主要是培养条件造成的 做成lysate 　时菌体已经打破 他想形成恐怕还没机会 : 又如果把经IPTG induce之後的菌液冰到4度c三个小时後再处理(lyse) : 也会造成inclusion body形成吗?: 问了一堆问题 同样的答案 如上 主要是因为培养条件 冷冻会让细菌的生长减到很慢 : 希望有经验的前辈们给我一些指示~~~ : 谢谢 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 138.26.192.37