※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : ※ 引述《werthers6925 (...)》之铭言： : : 首先, 问的问题还是像前面一位一样...请问...你的insert是怎麽来的?? : : 第一, 如果是从其他plasmid上切下来....那你应该可以check酵素的作用能力如何 : : 这应该比较没问题............... : : 第二, 如果你的insert是利用PCR的方式做出来.... : : 那你的primer上应该会有加Not I, Nco I cut site : : 请问在你这些cut site的5'端.....你是否有多加一些base?? : : (比较保险是加4各base, 但不同的enzyme需要的base数目也不同) : : 再来问vector的问题..... : : 请问...你的vector是用哪一种的?? : : NotI和NcoI是不是邻近的俩各cut site?? : : 你是否能确定你的vector作用很好?? : : 由於你所提供的作法和资讯太少.... : : 我们无法很精密地帮你找出问题的所在....只能靠猜测.... : : 我想....应该不是你vector的问题..... : : 主要原因应该在你的insert上.... : : 如果可以的话...希望你能写的详细一点...方便大家讨论.... : 不好意思,之前写得浅了 : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector : vector为pET23a 已接有另一段约1.4kb的基因 : insert已经接到另一TA vector上 为pTZ57R/T : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的浓度高 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一种enzyme!? digestion的方式是single digestion还是double digestion!? plasmid是用kit抽的还是用传统的抽法!? : 所以在gel extraction前 可确定在约100b.p.附近有一粗亮的band gel是用几%的!? elution kit是用哪家的!?(有的厂牌回收率不好) 51bp应该会在100bp之下吧 有办法的话附个电泳图会比较好 : competent cell也已确定无问题 ligase是用哪家的!? ligation的温度和时间是!? 你是transformation之後没长菌 还是长出来都是self-ligation!? 资讯多一点会比较好判断哪里出问题 我的经验是insert越小的越好接 做cloning有时很运气 有时随便接随便有 有时做到挂点都没用 -- 心一但开始动了，与沉静便划不上等号........ --

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