※ 引述《cayumi (far away)》之铭言： : ※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : : 不好意思,之前写得浅了 : : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector : : vector为pET23a 已接有另一段约1.4kb的基因 : : insert已经接到另一TA vector上 为pTZ57R/T : : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的浓度高 : 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一种enzyme!? : digestion的方式是single digestion还是double digestion!? : plasmid是用kit抽的还是用传统的抽法!? : : 所以在gel extraction前 可确定在约100b.p.附近有一粗亮的band : gel是用几%的!? elution kit是用哪家的!?(有的厂牌回收率不好) : 51bp应该会在100bp之下吧 有办法的话附个电泳图会比较好 : : competent cell也已确定无问题 : ligase是用哪家的!? ligation的温度和时间是!? : 你是transformation之後没长菌 还是长出来都是self-ligation!? : 资讯多一点会比较好判断哪里出问题 : 我的经验是insert越小的越好接 : 做cloning有时很运气 有时随便接随便有 有时做到挂点都没用 enzyme与ligase是用Promega的 elution kit是用Viogen的 plasmid也是用Viogen的midi kit抽 run plasmid 的gel为1% ; run insert的gel为2% plasmid为single digestion ligation的时间为4度 overnight transformation後没长菌 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(连续的) 故才可确定内含insrt 谢谢~^^ --

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