作者Adler (Adler)
看板Biotech
标题Re: [求救] cloning
时间Sun Feb 25 12:22:34 2007
※ 引述《cayumi (far away)》之铭言:
: ※ 引述《Adler (Adler)》之铭言:
: : 不好意思,之前写得浅了
: : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector
: : vector为pET23a 已接有另一段约1.4kb的基因
: : insert已经接到另一TA vector上 为pTZ57R/T
: : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的浓度高
: 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一种enzyme!?
: digestion的方式是single digestion还是double digestion!?
: plasmid是用kit抽的还是用传统的抽法!?
: : 所以在gel extraction前 可确定在约100b.p.附近有一粗亮的band
: gel是用几%的!? elution kit是用哪家的!?(有的厂牌回收率不好)
: 51bp应该会在100bp之下吧 有办法的话附个电泳图会比较好
: : competent cell也已确定无问题
: ligase是用哪家的!? ligation的温度和时间是!?
: 你是transformation之後没长菌 还是长出来都是self-ligation!?
: 资讯多一点会比较好判断哪里出问题
: 我的经验是insert越小的越好接
: 做cloning有时很运气 有时随便接随便有 有时做到挂点都没用
enzyme与ligase是用Promega的
elution kit是用Viogen的
plasmid也是用Viogen的midi kit抽
run plasmid 的gel为1% ; run insert的gel为2%
plasmid为single digestion
ligation的时间为4度 overnight
transformation後没长菌
另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(连续的)
故才可确定内含insrt
谢谢~^^
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