※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : ※ 引述《cayumi (far away)》之铭言： : : 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一种enzyme!? : : digestion的方式是single digestion还是double digestion!? : : plasmid是用kit抽的还是用传统的抽法!? : : gel是用几%的!? elution kit是用哪家的!?(有的厂牌回收率不好) : : 51bp应该会在100bp之下吧 有办法的话附个电泳图会比较好 : : ligase是用哪家的!? ligation的温度和时间是!? : : 你是transformation之後没长菌 还是长出来都是self-ligation!? : : 资讯多一点会比较好判断哪里出问题 : : 我的经验是insert越小的越好接 : : 做cloning有时很运气 有时随便接随便有 有时做到挂点都没用 : enzyme与ligase是用Promega的 Promega的enzyme我没用过 我只用过TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer 他们公司另外有出一种 2X rapid ligation buffer,我是都用这个 ligation buffer 我ligation的方法是 insert: 8μl vector : 3μl 2X buffer:12μl ligase: 1μl 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16个小时以上 以heat-shock的方法做transformation : elution kit是用Viogen的 我们家是用GeneMark的elution kit 个人认为满好用的 : plasmid也是用Viogen的midi kit抽 我plasmid都是用一般传统的mini-preparation抽的 : run plasmid 的gel为1% ; run insert的gel为2% 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分钟 : plasmid为single digestion 所以你vector有做CIP处理噜!? CIP处理时间太久会影响到你ligation喔 : ligation的时间为4度 overnight : transformation後没长菌 抗生素没用错吧 有看过很天兵的朋友用错抗生素 == ==+ : 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(连续的) 这个我觉得有点怪怪的 应该只会出现single band吧,不应该有连续的band吧 可是照理说用Kit抽应该不会有RNA的干扰才对,可以放张电泳图吗!? 还有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑电泳check吗!? : 故才可确定内含insrt : 谢谢~^^ 不久前我们lab的学妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上 我是敎她insert和vector都分别用NEB的enzyme做double digestion 用100V跑3%gel 40分钟,elution ligation的条件就如上述所说的 做个两次就出来了 你在踹看看吧 另外问一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,还是你自己在primer上设计的切位!? -- 心一但开始动了，与沉静便划不上等号........ --

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