※ 引述《cayumi (far away)》之铭言： : ※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : : enzyme与ligase是用Promega的 : Promega的enzyme我没用过 我只用过TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme : Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer : 他们公司另外有出一种 2X rapid ligation buffer,我是都用这个 ligation buffer : 我ligation的方法是 insert: 8μl : vector : 3μl : 2X buffer:12μl : ligase: 1μl : 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16个小时以上 : 以heat-shock的方法做transformation : : elution kit是用Viogen的 : 我们家是用GeneMark的elution kit 个人认为满好用的 : : plasmid也是用Viogen的midi kit抽 : 我plasmid都是用一般传统的mini-preparation抽的 : : run plasmid 的gel为1% ; run insert的gel为2% : 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分钟 : : plasmid为single digestion : 所以你vector有做CIP处理噜!? CIP处理时间太久会影响到你ligation喔 : : ligation的时间为4度 overnight : : transformation後没长菌 : 抗生素没用错吧 有看过很天兵的朋友用错抗生素 == ==+ : : 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(连续的) : 这个我觉得有点怪怪的 应该只会出现single band吧,不应该有连续的band吧 : 可是照理说用Kit抽应该不会有RNA的干扰才对,可以放张电泳图吗!? : 还有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑电泳check吗!? : : 故才可确定内含insrt : : 谢谢~^^ : 不久前我们lab的学妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上 : 我是敎她insert和vector都分别用NEB的enzyme做double digestion : 用100V跑3%gel 40分钟,elution : ligation的条件就如上述所说的 做个两次就出来了 : 你在踹看看吧 : 另外问一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,还是你自己在primer上设计的切位!? 我是用我自己在primer设计的切位 ㄜ...我之前说的连续的band,是指它是一整片,由一百分布至其下皆有 可能造成你的误会了... 抱歉..@@ 切RE的gel我没有照像耶...抱歉 我会用你的方法再试试的~^^ 谢谢你~ ps.抱歉这麽晚才回...@@ --

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