※ 引述《Adler (Adler)》之铭言： : ※ 引述《cayumi (far away)》之铭言： : : Promega的enzyme我没用过 我只用过TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme : : Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer : : 他们公司另外有出一种 2X rapid ligation buffer,我是都用这个 ligation buffer : : 我ligation的方法是 insert: 8μl : : vector : 3μl : : 2X buffer:12μl : : ligase: 1μl : : 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16个小时以上 : : 以heat-shock的方法做transformation : : 我们家是用GeneMark的elution kit 个人认为满好用的 : : 我plasmid都是用一般传统的mini-preparation抽的 : : 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分钟 : : 所以你vector有做CIP处理噜!? CIP处理时间太久会影响到你ligation喔 : : 抗生素没用错吧 有看过很天兵的朋友用错抗生素 == ==+ : : 这个我觉得有点怪怪的 应该只会出现single band吧,不应该有连续的band吧 : : 可是照理说用Kit抽应该不会有RNA的干扰才对,可以放张电泳图吗!? : : 还有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑电泳check吗!? : : 不久前我们lab的学妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上 : : 我是敎她insert和vector都分别用NEB的enzyme做double digestion : : 用100V跑3%gel 40分钟,elution : : ligation的条件就如上述所说的 做个两次就出来了 : : 你在踹看看吧 : : 另外问一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,还是你自己在primer上设计的切位!? : 我是用我自己在primer设计的切位 那如果是这样的话 你可以用含你的insert的plasmid(应该有定序过,确认序列无误吧!?)当作 DNA template 用"好一点"的taq(ex:takara 的ex-taq)做pcr primer就用你有设计切位的primer,总体积的话30-60μl皆可 pcr跑完之後,pcr product直接用1% gel去跑电泳,跑完之後做elute elute完之後的product,下个10 or 20 μl去做digestion,之後再elute 虽说pcr可能会有base出错的机会,但是若你taq用好一点,或是你用有pfu的taq 56bp应该是不太有机会出错的 : ㄜ...我之前说的连续的band,是指它是一整片,由一百分布至其下皆有 那就很怪啦 电泳图应该是长成这样子吧 marker --- ----- vector 100bp --- ----- insert 一整片我觉会不会是RNase没处理完全而残留的RNA呀 你plasmid抽完之後load个1-5μ去跑电泳 如果100bp附近有亮成一片的话 那个应该都是RNA啦 : 可能造成你的误会了... 抱歉..@@ : 切RE的gel我没有照像耶...抱歉 : 我会用你的方法再试试的~^^ 谢谢你~ : ps.抱歉这麽晚才回...@@ -- 心一但开始动了，与沉静便划不上等号........ --

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