作者rita1986 (朝目标迈进)
看板Biotech
标题[问题] GST-Fusion Protein的纯化
时间Fri Mar 2 19:57:03 2007
用IPTG induction完 加triton sonication後离心的上清液
跑SDS-PAGE可明显看到我要的 protein band
但用 glutathion sepharose 纯化完 protein 浓度很低
以下是我的 protocol
将 glutathion sepharose 4B 4c.c. 装入column
wash 2X wish cold PBS
wash 1X wish cold PBST
加 protein 上清液 (bind 2 hrs shack 4度C)
wash 2X wish cold PBST
wash 1X wish cold PBS
elute wish 20mM glutathion reduced
请达人们帮我看看哪里出问题
向各位求教了
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.163.64
1F：推 hkaiwei:有没有PAGE可以看一下? 03/02 23:36
2F：推 deathscytheX:你elute buffer是在PBS还是Tris?? 03/02 23:57
3F：推 bee:还有一个可能是蛋白没吸上 03/03 00:24
4F：推 rita1986:回2楼的~~是PBS里 没抓到蛋白 到底哪出问题??? 03/03 01:27
5F：推 NKTcell:问题应该在lysis buffer的成分 另一方面 如果运气够差的话 03/03 01:38
6F：→ NKTcell:有的蛋白就是抓不下来 即使有被induce出来 这是很吊诡的 03/03 01:39
7F：推 Bluecold:GSH-shepharose是怎麽equibriment的? 如果只用2Xbuffer 03/03 04:06
8F：→ Bluecold:可能不太够 建议用10x或是20X左右equibriment 03/03 04:07
9F：推 rita1986:X是我洗的次数 2X就是说6ml PBS洗两次 03/03 12:02
10F：→ rita1986:楼上的前辈是说要洗个10到20次体积的PBS 03/03 12:05
11F：推 cyken:可能是lysis buf的问题,把flow thru和wash出来的都拿去跑胶 03/03 12:10
12F：推 turtledodoha:如果你的protein没有要在进一步的purify或与其他 03/03 22:11
13F：→ turtledodoha:protein interaction，你可以直接加适量的SDS sample 03/03 22:12
14F：→ turtledodoha:buffer去煮，跑SDS-PAGE来check 03/03 22:13
15F：→ turtledodoha:是否有在2h内binding成功，wash後的上清液也可以确认 03/03 22:14
16F：推 deathscytheX:没抓到蛋白?所以拿Sepharose去loading也没有protein? 03/04 01:45
17F：推 rita1986:谢谢各位的解答 ^^~ 绝定先把triton改lysozyme破菌试试看 03/04 13:04