作者wanyi (我讨厌吃便当!!!!)
看板Biotech
标题[问题] NotI digestion的问题
时间Tue Mar 6 04:21:44 2007
最近在做cloning
好不容易把100bp的insert弄进plasmid之後
现在又遇上了NotI不切的问题
我要做的是一个double digestion (BsrGI/NotI)
因为两者buffer不一样~所以先切BsrGI
Qiagen kit purify之後再切NotI
之前有试过似乎要overnight才会切的比较好
但效果还是很差
我查过NEB的catalog说NotI是methylase sensitive
但是实验室没有Dam-/Dcm-的strain
想问大家有没有人在这样的情况下有比较好的方法
还是digestion overnight是唯一的方法呢?
对了，我现在用的是DH5 alpha competent cell
谢谢!!拜托高手帮忙~
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夜已晚的很美丽 天已亮的很分明
我在你的回忆里 是黄昏还是黎明
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◆ From: 140.180.7.220
1F：→ wanyi:对了补充一下 RE也是NEB的 03/06 04:22
2F：推 blence:NotI是CpG island sensitive,你上面的想法不是切不好的理由 03/06 06:36
3F：推 wanyi:谢谢你~我应该是误会了! 那请问有什麽方法可以解决吗? 03/06 14:06
4F：推 zytase:NotI,含切位:24个base->90% cleavage @ 37度 20小时 03/06 15:56
5F：→ zytase: 20个base以下->0~10% @ (同上条件) 03/06 16:02
6F：→ zytase:以上是针对 DNA fragments,基本上它是需要over night~ 03/06 16:04
7F：推 wanyi:谢谢你!!!那我还是努力的延长反应时间吧! 03/06 23:41
8F：推 oooya:请问有几个切点???切太久也不太好 主要还是要看你的用途为何 03/07 00:46
9F：推 wanyi:我的plasmid上只有一个NotI site,试过三个小时切不好 03/07 01:20
10F：推 oooya:请问已经做好的clone 要再把他切开来的目的为何? 03/07 17:54
11F：推 wanyi:要把一段gene用另一个PCR产物取代~ 03/08 01:54
12F：→ wanyi:所以我vector跟PCR product都要用NotI切 03/08 01:56
13F：推 shaline:会不会没加BSA啊?! 03/10 01:34