作者satantaco (TACO)
看板Biotech
标题Re: [问题]蛋白质表现的问题
时间Thu Mar 8 17:07:03 2007
※ 引述《satantaco (TACO)》之铭言：
我的insert约2.2kb
然後使用pET-30 EK/LIC vector
它是使用一段LIC序列 在insert两端
然後经过PCR後就可将产物放进vector中
接着我转型至novablue中挑选
也挑到了符合大小的plasmid
然後抽取後再转型至BL21(DE3)pLysS表达菌株中进行表达
表达的条件基本上是以37度 250rpm 养至O.D600=0.6然後加入终浓度1mM IPTG
再继续以37度 250rpm 培养三小时
但是抽出来的粗萃蛋白经过跑SDS-page後
在预估的大小片段位置却没有与未表现的控制组有差异
更改过表达温度
即加入IPTG後以30度或25度 20度等条件作诱导
但是粗萃蛋白依样没看到再预估的大小有差异
此外以his-tag column然後上AKTA Prime跑纯化
也没纯化出东西
而且elution洗下的fraction跑SDS-PAGE会有好几个片段
但没有主要的片段 而且也没有我预估要的大小
请问我要如何改进我的实验
麻烦大大们提供意见
目前我所想到的有在诱导时加入0.5~1%的葡萄糖
以及加入PMSF
目前正在进行
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◆ From: 140.121.156.30
1F：推 ermine:换个vector或换只菌吧 感觉上根本没表现出你要的蛋白质 03/07 22:14
如果还是没表现出来可能会尝试换只菌 目前进度可能这周末吧
2F：推 bee:你的状况很清楚.....蛋白应该是没有表现出来 03/08 07:24
3F：→ bee:either 回头去检查 cloning 有没有问题 or 你要换表达系统 03/08 07:24
4F：→ bee:加 glucose 的方法要从一开始 transform 然後利用短生长去挑菌 03/08 07:25
5F：→ bee:如果你确认 cloning 是对的才需要试这个 03/08 07:26
我有在诱导後的菌液离心取菌作colony PCR 质体又是对的
然後加glucose是protocol里有建议如果表现的基因对菌是有毒的话
可以加glucose稳定质体丢失的情形 增加表达
所以尝试看看 至於你说的利用短生长确认cloning的方法
在protocol里是说对於T7lac启动子及带有pLysS的质体并不可靠
6F：推 longy:去把你的质体抽出来 送定序吧~~先check这里~~ 03/08 16:42
定序的部份 在转型的选殖菌株Novablue时
已经定过序了 也再三确认过密码子
应该是没问题的
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◆ From: 140.121.156.30
7F：推 Jayc:换HOST阿~~ 要不然就换plasmid...pQE不知如何? 03/09 16:02